犁頭草黃酮含量的測定與分離

謝娟平，黨 鑫

(安康學院 秦巴中藥資源研發中心，陜西 安康 725000)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器試劑

犁頭草分別采集于安康市佛坪鎮、安康市漢濱區、渭南市、西安市等地。

紫外分光光度計UV-6100 PC(上海美普達儀器有限公司)；分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；超聲波清洗器KH2200E型(昆山禾創超聲儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱101-1AB型(天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉蒸發儀RE-52AA(上海雅榮生化儀器設備有限公司)；循環水式真空泵SHR-Ⅲ(西安泰康生物科技有限公司)。

蘆丁對照品(純度99.9%，上海友思生物技術有限公司)；薄層層析硅膠(硅膠G，青島海浪硅膠干燥劑廠)；羧甲基纖維素鈉(AR，天津市科密歐化學試劑有限公司)；無水乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯、結晶氯化鋁等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線

對照品溶液的制備。精確稱量蘆丁標準品20 mg，移至100 mL容量瓶中，70%乙醇定容，搖勻即得，備用[8]。

吸收波長的確定。取上述溶液70%乙醇稀釋5倍，于UV-6100 PC紫外可見分光光光度計上在200～800 nm波長范圍內掃描，得最大吸收波長為273 nm。

標準曲線的制備。取蘆丁標液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別于25 mL容量瓶中，加入5 mL 0.1 mol·L-1的AlCl3乙醇溶液，加入70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min，得一定濃度梯度的標準系列溶液。在273 nm波長處測定吸光度值[9-10]。分別以標準品的濃度及其相應的吸光度為橫縱坐標制作標準曲線，得相應的回歸線方程：A=0.034 5×C+0.005 5，R2=0.999 4，線性范圍為0.8～24.0 μg·mL-1。

1.2.2 樣品液制備

另外，公路養護單位還要加強對各項施工材料的控制力度，防止質量不達標的施工材料混入施工現場中。①瀝青材料，該項材料為公路養護的核心材料，在采購瀝青材料時，試驗檢驗部門需要定期抽查，一旦發現質量不達標的瀝青材料，禁止其進入到施工現場中，針對標號與產地各不相同的瀝青材料，需要將其進行分類存儲。②砂石與礦粉施工材料，檢修人員可以結合《公路工程試驗規程》條例，對砂石與礦粉等施工材料進行綜合檢測，對于檢測合格的施工材料，還要妥善存放，加強各項施工材料的防潮與防腐蝕等[3]。

取不同產地及不同生長期犁頭草，干燥，粉碎。分別精確稱量2 g，置于不同燒杯中，加入75%乙醇溶液20 mL，超聲提取30 min，稱重，75%乙醇補足重量，過濾，取濾液2 mL于10 mL容量瓶中，加75%乙醇溶液定容至刻度線。

1.3 精密度試驗

精確吸取1.2.2節下制備的安康市鎮坪縣犁頭草樣品溶液5份，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中加3 mL的0.1 mol·L-1AlCl3乙醇溶液，加70%乙醇定容，作為精密度試驗樣品溶液。取上述溶液于273 nm測定吸光度值，計算黃酮含量。

1.4 穩定性試驗

精確吸取1.2.2節下制備的安康市鎮坪縣犁頭草樣品溶液5份，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中同1.3節下操作，制備穩定性試驗樣品溶液。分別于0，10，20，30，40 min時在273 nm處測定吸光度值，計算黃酮含量。

1.5 樣品檢測

取1.2.2節下制備的安康市鎮坪縣、安康市漢濱區、渭南市、西安市、四川省廣元市犁頭草樣品溶液，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中同1.3節下操作，制備樣品溶液，分別測定吸光度。代入A=0.034 5C+0.005 5中計算黃酮含量，比較不同產地及不同生長期犁頭草總黃酮含量。

1.6 分離純化

取安康市鎮坪縣犁頭草，60 ℃干燥，粉碎，稱取1 000 g，加75%乙醇適量使粉末濕潤膨脹24 h，裝入滲漉桶中，加5倍量75%乙醇滲漉，收集滲漉液約40 L[11-13]。以上滲漉液平分為2份，1份減壓回收干燥并稱量備用，1份用來做系統分離。在最大吸收波長處測定吸光度值，計算犁頭草滲漉液中的總黃酮量。

用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對犁頭草滲漉液依次萃取，得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液及水溶液部分，減壓干燥，得各萃提產物，按1.2.2節下方法制備供試液并按1.3節下操作測定吸光度，計算各萃取部分的總黃酮含量[12]。

2 結果與分析

2.1 精密度和穩定性

由表1可知，按1.3節操作測定的黃酮含量為50.471 mg·g-1，相對標準差(RSD)為1.438%，表明方法的精密度良好。按1.4節下操作測定不同時間下樣品黃酮含量平均值為50.485 mg·g-1，RSD為0.863%，表明穩定性良好。

表1 方法學的試驗結果

2.2 黃酮含量

由表2可知，安康市鎮坪縣的犁頭草中總黃酮含量高達50.98%(故以此作為分離純化的原料)，且從3—5月生長期內，犁頭草中總黃酮含量呈增加趨勢。

表2 不同產地及生長期犁頭草中的黃酮含量

2.3 分離純化

2.3.1 提取

取1.6節下滲漉液20 L(相當于原藥材500 g)，按1.5節下方法在273 nm處測定吸光度值，代入回歸方程計算滲漉液黃酮濃度為0.918 1 mg·mL-1，相當于原藥材黃酮含量為36.724 mg·g-1(提取液含量為50.98 mg·g-1)，可知75%乙醇滲濾法提取犁頭草中的黃酮類物質的保留率為72.89%。滲漉液干燥共得粗提取物112.6 g，計算粗提物黃酮含量為16.31%。

2.3.2 系統分離

按1.6節下操作，進行分離純化，分別測定乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分及水溶液部分黃酮含量得到各萃取物部分黃酮總量。各萃取液濃縮干燥，得萃取物總量，如表3所示。

表3 各分離純化萃提物的黃酮含量

表3表明，乙酸乙酯萃取物中黃酮類物質的含量高達73.42%，說明犁頭草中的黃酮類成分主要富集在乙酸乙酯中，可選擇乙酸乙酯部分作為進一步分離純化及開發的主要原料。

3 小結

本文以蘆丁為對照品，0.1 mol·L-1的AlCl3乙醇溶液為顯色劑，運用紫外分光光度法在273 nm處測定了犁頭草中的總黃酮含量。精密度試驗結果RSD為1.438%，說明該方法的精密性良好。顯色穩定性試驗結果RSD為0.863%，根據不同時間間隔測得的吸光度可知，在該試驗條件下顯色產生的亮黃色絡合物比較穩定，可用來做定量分析。用上述方法對不同時間不同地點采摘的犁頭草進行檢測發現，安康市鎮坪縣的犁頭草總黃酮含量高達50.98%，3—5月犁頭草中的黃酮類物質隨著生長不斷積累增加。

研究采用75%乙醇為溶劑，滲漉法提取犁頭草中有效成分，粗提取物總黃酮含量高達16.31%，有效成分保留率為72.89%，產品純度高，是理想的犁頭草黃酮粗提取工藝。采用系統分離法分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對犁頭草提取物進行萃取，檢測可知正丁醇萃取物中黃酮類物質的含量為27.56%，乙酸乙酯萃取物中黃酮類物質的含量高達73.42%。萃取分離得到的犁頭草黃酮純度高，黃酮類化合物主要集中在乙酸乙酯部分，這為進一步研究犁頭草有效成分和相關保健產品的開發提供了基礎依據。

[1] 周馳. 紫花地丁的本草考證及化學成分研究[D]. 北京：北京中醫藥大學，2008.

[2] 鄭曉輝，沈澤培，黃楓. 犁頭草治療化膿性關節炎[J]. 中醫藥學刊，2005，23(8)：1526-1528.

[3] 張爭鳴. 犁頭冰散治療創傷性潰瘍120例[J]. 湖南中醫雜志，1996，12(5)：71-72.

[4] 李湘洲，欒芳菲，張勝，等. 黃酮類化合物的抗腫瘤和抗血管生成作用研究進展[J]. 食品與機械，2016，32(1)：199-201，206.

[5] 陽中和，國興明. 犁頭草化學成分研究初報[J]. 山地農業生物學報，2011，30(4)：374-376.

[6] 余燕影，彭志兵，曹樹穩. 紫外分光光度法測定豐城雞血藤中總黃酮[J]. 中草藥，2005，36(11)：1650-1651.

[7] 布雅楠，楊照生，閆正，等. 含羞草中總黃酮的提取與分離純化[J]. 化學分析計量，2016，25(5)：12-15.

[8] 謝娟平. 犁頭草中化學成分及總黃酮含量的研究[J]. 安康學院學報，2009，21(2)：95-97.

[9] ZHOU T，XIAO X，LI G，et al. Study of polyethylene glycol as a green solvent in the microwave-assisted extraction of flavone and coumarin compounds from medicinal plants[J]. Journal of Chromatography A，2011，1218(23)：3608.

[10] XIE J，ZHU L，LUO H，et al. Direct extraction of specific pharmacophoric flavonoids from gingko leaves using a molecularly imprinted polymer for quercetin[J]. Journal of Chromatography A，2001，934(1/2)：1-11.

[11] 王飛，樊金拴，馮慧英，等. 青扦針葉總黃酮超聲提取及抗氧化活性[J]. 西北林學院學報，2016，31(1)243-249.

[12] 謝娟平. 陜北苦蕎麥炒制前后不同部位黃酮含量的測定及分離[J]. 陜西農業科學，2016，62(6)：15-17.

[13] 李筱玲，鄧寒霜. 黃酮類化合物提取分離方法研究進展[J]. 陜西農業科學，2015，61(1)：77-79，92.