海洋柴油降解細(xì)菌的篩選鑒定及其生物表面活性劑特性

馬斌斌，馬恒軼，李少君，鄧歡歡*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035； 2.浙江省流域水環(huán)境與健康風(fēng)險研究重點(diǎn)實(shí)驗室，浙江 溫州 325035；3.溫州偉明環(huán)保能源有限公司，浙江 溫州 325000)

生物表面活性劑是由微生物細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊生物活性的物質(zhì)，可有效地降低空氣—水、油—水和固—液之間的界面張力[1]。生物表面活性劑不但囊括了化學(xué)合成表面活性劑的所有特性，而且還具有分子結(jié)構(gòu)多樣、選擇性廣泛，無毒、對生態(tài)環(huán)境友好，可生物降解，在高溫、高鹽、高pH等極端環(huán)境下能穩(wěn)定存在并發(fā)生作用的特性，臨界膠束濃度低，且發(fā)酵原料在自然界分布廣泛，是典型的“綠色”生產(chǎn)，在除油和生物生態(tài)修復(fù)方面具有巨大的應(yīng)用潛力[2]。

海洋是地球上最大的生物圈，約占地球總面積的70%，蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，為人類生存提供了巨大的生產(chǎn)資源，是人類在地球上賴以生存的最重要的物質(zhì)條件之一，然而它正遭受著人類生活和工業(yè)生產(chǎn)廢油的嚴(yán)重污染。面對這些海洋污染，人們習(xí)慣用化學(xué)方法進(jìn)行簡單處理，但是大多化學(xué)治理方法對環(huán)境易造成二次污染。大量研究認(rèn)為，以微生物為主的生物修復(fù)法具有更高的生物降解能力和環(huán)境兼容性。從長期受油污染的海水中篩選出能夠產(chǎn)生物表面活性劑的高效柴油降解菌是此類研究的關(guān)鍵[3]。本研究從浙江舟山漁場油污染嚴(yán)重的海水中分離篩選到一株柴油降解菌，現(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

本研究海水樣品取自浙江舟山油污染嚴(yán)重的定海碼頭和馬峙渡口，分別標(biāo)記為DH和MZ。取回的油污染嚴(yán)重的表層海水置于經(jīng)滅菌處理的采樣瓶中密封低溫保存，帶回實(shí)驗室。

1.2 培養(yǎng)基制備

富集培養(yǎng)基：NaCl 24.0 g，MgSO4·7H2O 7.0 g，NH4NO31.0 g，KCl 0.70 g，KH2PO42.0 g，Na2HPO4·12H2O 3.0 g，微量元素液5 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾的0#柴油2 mL，蒸餾水1 L，pH值7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：(NH4)2SO410 g，KCl 1.1 g，NaCl 1.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.28 mg，KH2PO43.4 g，K2HPO4·13H2O 4.4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母膏0.5 g，微量元素液0.5 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾的0#柴油2 mL，蒸餾水1 L，pH值7.4。

微量元素液：ZnSO4·7H2O 0.029 g，GaCl20.024 g，CuSO40.025 g，MnSO4·H2O 0.017 g，蒸餾水100 mL。

1.3 產(chǎn)生物表面活性劑柴油降解菌的篩選

1.3.1 柴油降解菌的分離和柴油降解率的測定

取10 mL海水樣品加到裝有100 mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃、200 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 d，然后移取10 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)液中，如此轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4次后進(jìn)行平板涂布，挑選不同的單菌落劃線分離，編號，-20 ℃斜面保存。

將各單菌落分別接種于以柴油為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)液中，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)7 d，然后用20 mL沸程為60～90的石油醚萃取發(fā)酵液中未降解的柴油，萃取液低溫高速離心10 min，取20 μL離心液稀釋10倍，用紫外分光光度法測定各單菌株的柴油降解率[4]。

1.3.2 排油圈直徑的測定

在直徑為90 mm的平皿中加入50 mL蒸餾水，然后將1 000 μL的液體石蠟緩緩加在蒸餾水表面，待其均勻鋪開形成油膜，在油膜中心加20 μL離心除去菌體的細(xì)菌發(fā)酵液，待其推開油膜形成排油圈，測定排油圈直徑[5]。

1.3.3 表面張力的測定

利用全自動表/界面張力儀測定發(fā)酵液的表面張力(空白樣的表面張力為74 mN·m-1)，每個樣品組測定3次取平均值[6]。

1.3.4 免疫溶血實(shí)驗

將純化的各單菌株點(diǎn)樣接種于血平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察單菌落周圍有無透明的溶血圈，并比較溶血圈直徑大小[7]。

1.4 菌種鑒定

通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗和16s rRNA序列分析，對篩選得到的產(chǎn)表面活性劑的菌株進(jìn)行菌種鑒定。首先將菌株接種于DifcoTMMatine Agra 2216培養(yǎng)基，28 ℃純化培養(yǎng)1 d，提取基因組DNA，將DNA稀釋至70 ng·μL-1用作PCR擴(kuò)增模板，利用正向引物(5′-3′，AGAGTTTGATCCTG GCTCAG)和反向引物(5′-3′，GGTTACCTTGTTA CGACTT)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系25 μL為模板DNA 0.5 μL，10×buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgCl24 μL，dNTP 1 μL，正反向引物各1 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL。擴(kuò)增結(jié)束后測序，測序結(jié)果利用細(xì)菌模式網(wǎng)站(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)和NCBI進(jìn)行對比，找出同源性最高的已知菌種，從GenBank數(shù)據(jù)庫中找出近源菌株的16s rRNA序列，與測定序列共同進(jìn)行Clustal X程序校準(zhǔn)多序列比較，再用MEGA6軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 生物表面活性劑的鑒定及特性分析

1.5.1 表面活性劑的提取

發(fā)酵液在4 ℃、12 500 r·min-1條件下離心30 min去除菌體，用6 mol·L-1的HCl調(diào)上清液pH值至小于2.0，4 ℃過夜。然后將相同體積上清和氯仿-甲醇(V∶V為4∶1)溶液共同加到梨形分液漏斗中萃取沉淀，有機(jī)相減壓蒸餾得到表面活性劑粗品，將粗品溶于0.5 mol·L-1的NaHCO3溶液中過濾，用6 mol·L-1的HCl調(diào)濾液pH值為2.0，4 ℃靜置24 h，4 ℃、12 500 r·min-1再次離心15 min收集沉淀，真空冷凍干燥得成品。

1.5.2 薄層色譜

將表面活性劑純品溶于甲醇溶液，點(diǎn)樣于硅膠板，以氯仿-甲醇-水(V∶V為4∶3∶2)為流動相進(jìn)行表面活性劑展層。然后在硅膠板上均勻噴灑酸性茚三酮溶液，110 ℃條件下顯色10 min，脂質(zhì)表面活性劑顯紅色斑點(diǎn)[8]。

1.5.3 傅里葉變換紅外光譜

取1 mg表面活性劑純品壓片于4 000～400 cm-1光區(qū)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.5.4 氣相質(zhì)譜脂肪酸分析

取5 mg的表面活性劑純品，用1 mL 6 mol·L-1的HCl溶液90 ℃水解24 h，然后加入5 mL的超純水，用1 mL乙醚萃取3次，合并萃取相并吹干，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的硫酸甲醇溶液，55 ℃條件下酯化360 min。加入5 mL的超純水，乙醚萃取3次，合并吹干，加入0.5 mL甲醇超聲溶解，過濾，進(jìn)行GC/MS分析。氣相色譜條件：高純度氦氣(99.999%)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，流速1 mL·min-1，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL。程序升溫條件：起始溫度120 ℃維持3 min，10 ℃·min-1升溫至260 ℃，維持5 min。質(zhì)譜條件：EI離子源溫度230 ℃，電力電壓70 eV，四極桿溫度150 ℃[9]。

1.5.5 乳化性能和臨界膠束濃度測定

取各菌株發(fā)酵液和液狀石蠟各5 mL分別加入試管中，漩渦振蕩2 min混勻，室溫靜置24 h后測量乳化層高度，乳化穩(wěn)定值(E24)=乳化層高度/液體總高度×100[10]。

將表面活性劑純品配成100%～0梯度濃度的溶液，用表面張力儀于室溫下測定各濃度的表面張力，繪制濃度-表面張力曲線，確定臨界膠束濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的篩選

經(jīng)過富集培養(yǎng)、測定各菌株的柴油降解率，初步篩選出7株柴油降解菌，依次標(biāo)記為DHA、DHB、DHC、DHE、MZA、MZB、MZC(表1)，其中，菌株DHA對柴油的降解率最高，達(dá)82.7%，且免疫溶血為陽性(圖1)，排油圈直徑為6.0 cm，高于其他菌，發(fā)酵液體表面張力可從74 mN·m-1降至21.66 mN·m-1，明顯低于其他菌株的表面張力。綜合以上結(jié)果，判定菌株DHA產(chǎn)生了表面活性劑。

2.2 降解菌株的鑒定

DHA菌株的生理生化實(shí)驗結(jié)果如下：革蘭氏染色，陽性；MR反應(yīng)，陰性；VP反應(yīng)，陰性，蔗糖發(fā)酵，陽性；檸檬酸實(shí)驗，陰性；明膠液化，陰性；吲哚實(shí)驗，陰性；硫化氫實(shí)驗，陰性。對菌株DHA的16s rRNA序列進(jìn)行比對分析，選取同源性高的16s rRNA序列，利用MEGA 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并將結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結(jié)合泊杰氏細(xì)菌鑒定手冊，DHA被最終鑒定為不動桿菌(Acinetobacter)。

表1 柴油降解率、免疫溶血、排油圈、 表面張力實(shí)驗結(jié)果

注：+表示陽性反應(yīng)，-表示陰性反應(yīng)。

圖1 DHA菌株的免疫溶血實(shí)驗結(jié)果

圖2 菌株DHA的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 表面活性劑的鑒定

2.4 表面活性劑的組成

通過GC/MS對脂肽脂肪酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)組成分析，總離子色譜圖如圖5所示，質(zhì)譜圖如圖6所示。圖中質(zhì)核比m/z=103的基峰為典型的β-羥基脂肪酸甲脂的特征峰，即[CH(OH)CH2COOCH3]+離子碎片。β-羥基脂肪酸甲脂離子峰失去(CH3OH+H2O)、H2O和H分別產(chǎn)生M-50、M-18、M-1的離子碎片峰，據(jù)此可得出，脂肪酸甲脂為C15β-羥基脂肪酸甲脂，所以菌株DHA產(chǎn)生的表面活性劑主要是由C15β-羥基脂肪酸構(gòu)成的。

2.5 表面活性劑的特性

經(jīng)測定和計算，菌株DHA產(chǎn)生的生物表面活性劑乳化效率高達(dá)64.7%，臨界膠束濃度為52.2 mg·L-1(圖7)。

圖3 產(chǎn)物的薄層色譜

圖4 產(chǎn)物的紅外光譜掃描

圖5 產(chǎn)物水解酯化后的總離子色譜

圖6 脂肪酸甲脂的質(zhì)譜

圖7 表面活性劑表面張力曲線

3 小結(jié)與討論

本研究從浙江省舟山漁場柴油污染的海水中篩選得到1株產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑的高效柴油降解菌株DHA，經(jīng)鑒定為不動桿菌(Acinetobacter)，其對柴油的降解率達(dá)82.7%，發(fā)酵產(chǎn)生的表面活性劑為脂肽，乳化效率為64.7%，臨界膠束濃度為52.2 mg·L-1，主要由C15長鏈脂肪酸構(gòu)成。

生物表面活性劑具有化學(xué)表面活性劑不具備的特殊性能，對疏水性有機(jī)化合物具有很好的乳化作用，因而能有效地提高環(huán)境中難降解有機(jī)污染物的生物降解速率；因此，產(chǎn)生物表面活性劑的微生物在生態(tài)環(huán)境修復(fù)中具有很好的應(yīng)用潛力。產(chǎn)生物表面活性劑的微生物廣泛存在于自然環(huán)境中，尤其是在有機(jī)污染物污染的環(huán)境中，比如煉油廠的地面土壤、廢水和廢油中[11]。從被原油污染的海水中分離篩選出產(chǎn)生物表面活性劑微生物的研究已有報道：Hassanshahian等[12]從波斯灣和里海被污染的海水中分離得到25株原油降解菌株，其中有11株可產(chǎn)生生物表面活性劑；Yateem等[13]從被柴油污染的土壤中篩選到1株可降解柴油的枯草芽孢桿菌，該菌株可產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑。本研究證明，舟山海洋生態(tài)系統(tǒng)中存在廢油降解微生物，這些廢油降解微生物可產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑，這為浙江近岸海域油污染海水的生物修復(fù)提供了生物材料與科學(xué)依據(jù)，對進(jìn)一步治理海洋環(huán)境污染具有一定的參考價值和應(yīng)用潛力。

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