巴迪亞壽的組織培養及育苗技術

茅汝佳，高 燕

(上海植物園 上海城市植物資源開發應用工程技術研究中心，上海 200231)

壽為百合科瓦葦屬(Haworthia)多年生草本植物[1]，原產于南非。大多數壽葉片呈蓮座狀緊密排列，有線狀脈紋[2]。巴迪亞壽(Haworthiamirabilisvar. badia)是近些年雜交出的新的園藝品種，屬于硬葉類植株，葉緣有白色小刺，葉表面有白色條紋，呈現透明或半透明的窗[3]，松散總狀花序，白色小花。由于其外形可愛、生長緩慢，備受園藝工作者和花卉愛好者的喜愛。

瓦葦屬植物很多品種自交不親和[4]。目前市面上的大多為分株繁殖和葉插繁殖，這類方法都存在繁殖速度慢、繁殖系數低、生長速度慢等問題，而采用組織培養的方法可以很好地解決。近些年，同屬部分多肉品種組培獲得成功，目前有康平壽[5]、截型十二卷[6]、克里克特壽[7]、冰沙糖壽[8]等多肉品種組織培養的相關報道。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗于2015—2016年在上海植物園科研中心實施。巴迪亞壽取自上海植物園多肉館，如圖1。在幼嫩花序抽長并且花蕾尚未展開時，截取整個花莖部位作為起始材料。

圖1 巴迪亞壽幼嫩花序

1.2 方法

取巴迪亞壽幼嫩花序部位，去除閉合花蕾的外苞片，將花蕾連同花柄逐個分離，放置玻璃瓶中，紗布封口?；ㄐ虿课幌扔孟礉嵕芤航?0 min，后在流水下沖洗2 h。準備酒精燈、75%乙醇、2%次氯酸鈉溶液、0.1%升汞溶液。提前滅菌以下材料：玻璃瓶裝ddH2O、封口100 mL三角瓶、紗布、鑷子、手術刀、濾紙。

1.2.1 滅菌

以下工作均在超凈工作臺中完成：外植體放置于無菌三角瓶中，用無菌水沖洗2次后，75%乙醇振蕩清洗30 s，再用無菌水沖洗2次。隨后用2%次氯酸鈉溶液和0.1%升汞溶液兩種消毒液對外植體消毒，再用無菌水沖洗6次后，濾紙吸干水分，放置于培養基上。消毒液和消毒時間的差異對外植體誘導有不同的影響，根據誘導階段出芽的差異確定最佳消毒辦法。

1.2.2 誘導培養

利用MS為基本誘導培養基，添加不同濃度的激素。激素采用細胞分裂素6-BA和生長素NAA形成不同組合，6-BA的濃度范圍為0～2 mg·L-1，NAA的濃度范圍為0～0.2 mg·L-1。根據誘導結果確定最佳誘導培養基組合。

1.2.3 增殖培養

利用MS為基本培養基，添加不同激素，配置增殖培養基。激素采用細胞分裂素6-BA和生長素NAA形成不同組合，6-BA的濃度范圍為0～2 mg·L-1，NAA的濃度范圍為0～0.04 mg·L-1。根據增殖階段植物的生長狀態和增殖率確定最佳增殖培養基。

1.2.4 生根培養

以1/2MS為基本培養基，添加不同濃度激素，激素分別采用IAA、IBA、NAA 3種，濃度范圍為0～1 mg·L-1，配置成不同的生根培養基。根據苗生長狀態、根生長狀態、生根率和根長等確定最佳生根培養基。

1.2.5 馴化移植

組培生根后，在自然光照下培養1周，揭開瓶蓋放置3 d。取出組培苗放置水盆中，清洗附著在苗上的培養基。將清洗過的組培苗放置陰干一周后，整理根并種植于穴盤中。

1.2.6 育苗培養

組培苗在馴化移植成功后，從穴盤轉至營養缽中?；|仍然采用草炭∶火山石∶鹿沼土∶赤玉為3∶1∶1∶2(V∶V)。室內溫度保持20 ℃左右，濕度85%，每1個月澆水使用多菌靈溶液起到殺菌的功效。如有條件，可以每月施加薄肥一次。

2 結果與分析

2.1 滅菌方法的篩選

滅菌材料為壽幼嫩花序，每1.0～1.5 cm截取成一小段，分離單個未展開花蕾，去除苞片。在經過初步洗潔精和流水浸泡沖洗后，先用75%乙醇浸泡30 s，清水沖洗2次，再嘗試2種滅菌液滅菌，分別為2%次氯酸鈉溶液和0.1%升汞溶液。由于兩種滅菌液的滅菌效率不同，對外植體的傷害也不同，選取適合的滅菌時間尤為重要。實驗中，用2%次氯酸鈉溶液分別對外植體滅菌6、12和18 min，用0.1%升汞溶液分別對外植體滅菌5、8和11 min，獲得不同的污染率和出芽率。如表1所示，用2%次氯酸鈉溶液滅菌12 min時，相比較同滅菌液的另外兩個滅菌時間，出芽率最高為35%，此時對應的污染率為12.5%。當用2%次氯酸鈉溶液滅菌18 min時，污染率比12 min的滅菌時間更低，僅為2.5%，但是由于滅菌液對外植體的滅菌時間過長，出芽率降低為7.5%。與之對應，采用0.1%升汞溶液作為滅菌液，滅菌8 min時，污染率為7.5%，此時的出芽率為75%，而滅菌時間達到11 min后，污染率為0，此時的出芽率降低為5%。綜合比較，以高出芽率和正常出芽形態為目的，用0.1%升汞溶液滅菌8 min為最佳的滅菌方法，此時污染率為7.5%，而出芽率達到75%。

表1 不同滅菌液和滅菌時間對巴迪亞壽誘導 脫菌的影響

2.2 誘導階段激素選擇

以MS為基本培養基，添加6-BA和NAA兩種激素。生長素和細胞分裂素是組織培養誘導階段常使用的激素，適當的激素濃度配比可以促進組織誘導。

滅菌后的起始材料接種于誘導培養基上，培養基添加細胞分裂素6-BA和生長素NAA。如表2所示，6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1時，誘導率最高為66.7%。此時，15 d左右可以出芽，生長速度較快且芽體發育正常。不添加激素的基本培養基上未能誘導出芽，最后起始材料呈灰褐色。只添加了NAA的情況下，誘導情況不理想，僅在NAA 0.1 mg·L-1時，有少量芽出現，誘導率僅為6.7%，且芽生長極為緩慢。當6-BA 1 mg·L-1時，少量細弱的芽出現，且生長較慢。6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.2 mg·L-1時，15 d左右誘導出芽，在此情況下誘導出的芽生長較快且發育正常，此時誘導率為26.7%，基部有少量球形綠色愈傷形成。6-BA 2 mg·L-1時，芽的誘導率僅為13.3%，同時有少量綠色愈傷組織。當6-BA 2 mg·L-1，而NAA的含量升高達到 0.2 mg·L-1時，芽開始出現畸形的現象，芽體變形，芽膨大，玻璃化明顯，基部有愈傷。

表2 不同激素含量對壽誘導的影響

由此可以看出，6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1是最適合芽誘導的培養基組合，此時芽誘導率66.7%，沒有形成愈傷組織。

2.3 增殖階段激素選擇

經過誘導培養基接近1個月的培養，將誘導的芽轉至增殖培養基。如果芽基部有愈傷，撥除干凈再轉至培養基。

表3看出，不同激素濃度對巴迪亞壽的芽增殖有不同的影響。當不含6-BA時，增殖率較低，最高的只有1.85倍，苗伸長倍率最高也僅為1.39倍，整體來說略有生長，但是生長較弱。當6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.02 mg·L-1時，芽的伸長倍率為2.65倍，對應的增殖倍率達到最大，為4.62倍，葉片生長明顯，形成大量新芽。當6-BA為2 mg·L-1時，芽的伸長和增殖倍率都略有下降，葉片細長，部分出現基部愈傷的現象。特別當6-BA和NAA濃度較高的時候，芽膨大變形成為綠色半透明的畸形苗，出現玻璃化現象。圖2看出，在增殖培養基(6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.02 mg·L-1)上培養25 d，芽生長健壯，沒有畸形和玻璃化的情況。

表3 不同激素含量對巴迪亞壽芽增殖的影響

2.4 生根培養

將增殖的芽分成單株取出轉接于生根培養基?；九囵B基為1/2MS，添加IAA、IBA、NAA 3種激素，觀察壯苗結果和生根情況。

根據表4可以看出，3種不同激素對植株影響有較大差異。完全不添加激素的情況下，僅1/2MS培養基使植株略有生長，但非常有限，植株整體基本沒有粗壯，沒有形成根。添加IBA后，苗上部分生長正常(圖3)，但是無法形成或者僅少量形成根，IBA 0.5 mg·L-1時，根的長度為0.5～1.0 cm。添加 NAA后，植株下端形成愈傷，且無法形成根。添加IAA 0.5 mg·L-1的情況下，植株粗壯，形態正常，部分生長良好可以看到窗，且形成粗壯根，根平均數量6～10根，長度2～7 cm。

表4 不同激素含量對巴迪亞壽壯苗和生根的影響

注：起始材料為莖段。

圖2 壽增殖培養25 d的植株

圖3 生根培養1個月后形成根

2.5 馴化移植

組培苗形成完整植株后，可以轉至穴盤煉苗。穴盤中裝入的基質為草炭∶火山石∶鹿沼土∶赤玉為3∶1∶1∶2(V∶V)。種植組培苗于穴盤后，少量澆水，上方安置遮光網，放置于大棚內，溫度20 ℃，濕度85%左右(圖4)。生長2個月，壽成活率可達98%。從土中挖出根，可以看到根相比較前期伸長明顯，且部分形成新根。

圖4 馴化移植3個月后的巴迪亞壽

2.6 育苗技術培養

巴迪亞壽喜歡涼爽通風的半陰環境。在自然狀態下培養時，一般春、秋兩季養護較易，而高溫的夏季或者低于0 ℃的冬季，巴迪亞壽處于半休眠至休眠狀態，生長緩慢或停止。養護時，要注意通風、涼爽和干燥，可選擇適當遮陰，避免烈日暴曬和長期雨淋。巴迪亞壽喜歡空氣濕度略高的環境，但不可頻繁澆水或積水，防澇防浸泡。初期的小苗可以用帶蓋的育苗盤種植，用以保持空氣中的水分。但是夏季高溫時需要去除育苗盤的蓋子，防止植物因悶濕而死亡。

巴迪亞壽對光照較敏感。植株的生長于光照有直接關系。光照過強會導致葉片灼傷，而光照太弱會導致植株生長散漫不緊湊，并且“窗”透明度差。恰當的光照才能讓巴迪亞壽有完美的株型和明亮的“窗”。

3 小結與討論

植物組織培養是植物快速繁殖最有效的辦法，相比較葉插、播種等方法有很多優勢，例如繁殖速度快，繁殖系數大；繁殖后代整齊，遺傳性狀得以保持；可獲得脫毒苗等。植物組織培養需要選用適合的外植體，外植體可以從新生側芽、葉片、花序和種子等方面選擇。但因為新芽發生部位在根部接近土壤處，難滅菌，葉片分生能力較差，后期分化也比較弱；種子為雜交產物，母體的優良性狀難以保持，因此細胞分裂旺盛的花序是很好的起始材料[9]。花序經過滅菌后可以作為誘導材料。次氯酸鈉利用分解的氯氣殺菌，毒性較小。升汞是一種劇毒物質，利用其重金屬汞離子破壞微生物蛋白質的方法殺菌。在本實驗中，利用0.1%升汞振蕩滅菌8 min是比較適合的滅菌方法，污染率為7.5%，出芽率為75%。升汞滅菌后，需要用滅菌水多次振蕩沖洗，本實驗中沖洗6次，盡可能漂洗升汞殘留物，減少升汞對外植體的傷害。

將滅菌的壽接種至誘導培養基，誘導培養基添加了6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1，此組合可以獲得較高的誘導率，同時誘導出的芽體發育正常，沒有出現膨大或者玻璃化，可以保證后續過程中芽的正常發育。

分離芽體轉至適宜的增殖培養基。增殖培養基添加6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.02 mg·L-1，可以保證芽體正常發育，沒有出現膨大或者玻璃化，另外也保證了巴迪亞壽的增殖率和伸長率。在此培養條件下，伸長率為2.65倍，增殖率為4.62倍，植株正常發育。

實驗后期的生根過程中，分別添加3種激素對比后，發現1/2MS附加激素IAA 0.5 mg·L-1，組培苗生長健壯，發育正常，沒有畸形和愈傷發生，并且可以形成粗壯根，每株平均6～10根，長度2～7 cm。另外，每瓶種植少量苗可以促進植株發育。實驗中每瓶種植1～2棵明顯比種植4～6棵的粗壯。組培壯苗的過程可以促進巴迪亞壽快速生長，打破自然狀態下壽長勢緩慢的特點。

常規多肉繁殖方法有分株繁殖、葉插繁殖和播種繁殖。分株和葉插兩種繁殖方法有很多相似的地方，例如取得健康植株上部或者肉質葉后，放置在干燥的地方，涂抹多菌靈，防止傷口腐爛。在傷口晾干后，直接扦插入土，保持土壤濕潤可以促進基部生根、植株成活。本實驗中嘗試生根苗種植和未生根苗瓶外生根兩種方法。實驗過程中為防止植物長菌，可以用稀釋的多菌靈浸泡10 min再晾干。未生根苗的生根方法與葉插法一致。在隨后兩個月的觀察中發現，未生根苗的根可以在土中生長出，但是生長速度較慢，且根相比較已生根苗細軟。半年后觀察兩種苗，生根苗長勢旺盛，而未生根苗相比弱很多。因此，組培中生根的步驟值得保留。

馴化成功后，將生長健壯的苗從營養缽中轉至盆中生長，但是夏季高溫的時候不適合巴迪亞壽的轉移。轉苗時，盆底放置5～6粒奧綠緩釋肥(意大利撒得盼化學公司Sadepan Chimicas.r.l)，再添加基質草炭∶火山石∶鹿沼土∶赤玉為3∶1∶1∶2(V∶V)。通透性較好的基質有助于根的健康生長。轉盆初期不加其他肥料，防止植物不耐受。轉盆兩個月后，每月噴施氮、磷、鉀有效養分各為20%的通用型花多多水溶速效肥，稀釋濃度為1%。生長期澆水掌握不干不澆，澆則澆透的原則，避免積水，更不能淋雨，尤其不能長期淋雨，以避免爛根，但也不宜長期干旱，否則葉片干癟，葉色黯淡[10]。

[1] 宋曉濤，沈萌，左志宇，等.十二卷屬植物西山壽的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊，2007,43(5):883-884.

[2] 王燕，牟豪杰，呂永平，等.壽錦的離體植株再生及組培產業化增殖[J].植物學報，2017,52(3):331-336.

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[5] 孫濤，金蕊，李德森. 康平壽的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學報，2003,39(3)：232.

[6] 孫濤，李德森. 截型十二卷的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學報，2002,38(6)：586.

[7] 左志宇，李建希，安曉云，等.克里克特壽的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學報，2007,43(2)311-312.

[8] 牟豪杰，王燕，呂永平，等.冰沙糖壽組培快繁研究[J].安徽農業科學，2016,44(32)：140-141,157.

[9] 郭生虎, 朱永興，關雅靜.百合科十二卷屬玉露的組培快繁關鍵技術研究[J].中國農學通報，2016,32(34)：85-89.

[10] 兌寶峰.玉露的栽培繁殖[J].中國花卉園藝，2009, 3(6): 34-35.