蛋白質(zhì)組學(xué)在非小細(xì)胞肺癌生物標(biāo)記和靶向藥物治療中的應(yīng)用進展

寧德利，金銘，徐濤，孫輯凱，李敏

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

肺癌是目前全球發(fā)病率、病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌病例的85%[2]，其主要的組織學(xué)類型為鱗狀細(xì)胞癌(SqCC)和腺癌(ADC)[3]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，生物標(biāo)記及藥物靶向治療成為腫瘤治療的發(fā)展方向和有效手段。特別是隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)作為可以對整體蛋白表達(dá)進行有效估量的工具[4]，已廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)記和藥物靶向治療，使NSCLC患者有望得到個性化治療。現(xiàn)就蛋白質(zhì)組學(xué)在NSCLC生物標(biāo)記和靶向藥物治療中的應(yīng)用進展進行綜述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)在NSCLC生物標(biāo)記中的應(yīng)用

1.1 診斷性生物標(biāo)記 在NSCLC發(fā)生發(fā)展中，常伴有某些蛋白質(zhì)的過量表達(dá)或抑制表達(dá)，通過比較正常樣本及患病樣本在蛋白質(zhì)種類和豐度上的表達(dá)差異，可以確定和篩選特異的NSCLC標(biāo)記物，將有助于肺癌的早期診斷。

肺癌中一般檢測不到癌胚抗原(CEA)的特異性，其在NCSLC的敏感性只有40%～70%，因此肺癌發(fā)展早期臨床診斷的效率低下。近來有學(xué)者[5]通過同位素相對標(biāo)記及絕對定量(iTRAQ)與液相-串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)，對凝集素親和層析富集的NCSLC患者血清進行研究，發(fā)現(xiàn)糖蛋白AACT在NSCLC早期階段表達(dá)量降低。此外，還發(fā)現(xiàn)GlcNAc糖基化的AACT可作為NCSLC早期診斷的標(biāo)記物。Marien等[6]采用基于質(zhì)譜的磷酸脂質(zhì)組學(xué)鳥槍法和雙向脂類組學(xué)圖譜分析技術(shù)，對NSCLC和與其配對的正常肺組織樣本磷脂數(shù)據(jù)進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中鞘磷脂(SMs)表達(dá)量顯著降低，而特定磷脂酰肌醇(PI)顯著升高。這些脂類標(biāo)記能夠說明NSCLC或其亞型存在，此種方法將成為NSCLC的有效診斷工具。

鈣網(wǎng)蛋白(CANX)在血清中的表達(dá)水平對NSCLC的疾病進程具有重要意義。Kobayashi等[7]采用聯(lián)合免疫沉淀反應(yīng)、基質(zhì)輔助激光解析離子化-飛行時間-質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)和反相蛋白陣列技術(shù)，分析肺癌患者和正常對照的血清樣本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CANX水平在肺癌第一階段就上調(diào)表達(dá)，并且隨著病情的加重，CANX表達(dá)水平顯著升高。因此，血清CANX水平可作為早期肺癌檢測標(biāo)記。

Liu等[8]采用深度非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對胸腔積液樣本進行研究。發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的肝細(xì)胞生長因子受體(MET)、二肽基肽酶4(DPP4)和蛋白酪氨酸磷酸酶受體F(PTPRF)的蛋白水平表達(dá)顯著高于良性對照組。該研究表明，用這種方法建立一個新的胸腔積液蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)庫，有利于從良性腫瘤中鑒定出NSCLC的治療靶點。

蛋白糖基化在癌細(xì)胞生長、分化和遷移過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。Yang等[9]對NSCLC的兩個亞型ADC和SqCC做了糖基化蛋白和總蛋白的組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(ELANE)和類胰島素生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)兩個糖基化蛋白在SqCC中高度表達(dá)，而聚集蛋白多糖(ACAN)、層粘連蛋白亞基γ-2(LAMC2)、凝血栓蛋白1(THBS1)、生長因子β1結(jié)合蛋白1(LTBP1)、鞘脂激活蛋白(PSAP)和膠原蛋白Ⅰ型α2(COL1A2)在ADC中高度表達(dá)。此外，通過信號網(wǎng)絡(luò)分析軟件可以鑒定NSCLC致病相關(guān)蛋白的上游調(diào)控因子。

吸煙者患肺癌的比例是不吸煙者的15～30倍。Rice等[10]應(yīng)用同位素相對標(biāo)記相對與絕對定量技術(shù)，對吸煙者和不吸煙者的血漿樣本進行研究，發(fā)現(xiàn)吸煙者血漿樣本中的載脂蛋白E(Apo E)表達(dá)水平顯著高于不吸煙者。此外還發(fā)現(xiàn)，鱗狀轉(zhuǎn)移瘤惡化前Apo E在血漿和組織中表達(dá)有著重要的聯(lián)系。Apo E的表達(dá)水平是一種新的鱗狀轉(zhuǎn)移瘤早期形態(tài)變化的診斷生物標(biāo)記物。

1.2 預(yù)測性生物標(biāo)記 蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為肺癌治療新靶點的鑒定帶來了新的變革。Xiao等[11]利用鏈親和素瓊脂糖Pulldown實驗及蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定，確認(rèn)Ku80(參與修復(fù)破碎DNA雙鏈的Ku二聚體)是一種作為環(huán)氧化酶-2(COX-2)基因啟動子的新型結(jié)合蛋白，轉(zhuǎn)錄輔激活子CRED結(jié)合蛋白(CBP)的過表達(dá)可以增加Ku80乙酰化作用，從而促進COX-2表達(dá)和腫瘤的生長，提示Ku80是肺癌發(fā)生和發(fā)展的一個潛在的治療靶點。Xu等[12]采用基于細(xì)胞同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定經(jīng)紫杉醇處理的細(xì)胞蛋白質(zhì)豐度變化，發(fā)現(xiàn)程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)表達(dá)下調(diào)，肺癌組織中的PDCD4高水平表達(dá)與接受紫杉醇治療的肺癌患者生存時間呈正相關(guān)，表明PDCD4為潛在的肺癌患者抵抗紫杉醇的預(yù)測標(biāo)記。

納米顆粒載藥化療法可以提高藥物輸送效果和減少毒性。為了更好地了解耐藥細(xì)胞對納米顆粒治療法的響應(yīng)，Zhao等[13]利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，研究白蛋白結(jié)合型納米顆粒紫杉醇治療NSCLC細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)環(huán)指蛋白139(RNF139)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶1(HMGCS1)在脂質(zhì)代謝過程中過表達(dá)，與白蛋白結(jié)合型納米顆粒紫杉醇抗性相關(guān)，表明這些蛋白質(zhì)可能是預(yù)測納米顆粒治療NSCLC抗性的生物標(biāo)記物。此外，Walker等[14]利用一個八通道同位素標(biāo)簽串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，檢測患者在放療前和放療中的血漿樣本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，放射治療1周后的C反應(yīng)蛋白(CRP)和富亮氨酸α2糖蛋白1(LRG1)在生命延長的群體樣本中有顯著變化，為進一步?jīng)Q策NSCLC患者是否接受放射治療提供實驗依據(jù)。

為能夠接受靶向治療的患者找到預(yù)測標(biāo)志物，是制定有效治療方案的必要因素。事實上，Cho[15]在比較NSCLC細(xì)胞的抗藥性和敏感性時發(fā)現(xiàn)，蛋白翻譯后磷酸化變化明顯比轉(zhuǎn)錄水平的劇烈。提示蛋白表達(dá)和翻譯后修飾可為靶向藥物治療患者的潛在標(biāo)記提供依據(jù)。

1.3 預(yù)后性生物標(biāo)記 針對癌癥患者選擇不同方案的治療結(jié)果，預(yù)后標(biāo)記可作為識別和分析的一個重要工具。Wang等[16]利用基于SILAC的定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合免疫沉淀技術(shù)，對侵襲肺ADC的特異核轉(zhuǎn)運蛋白(KPNA2)蛋白復(fù)合體進行研究，發(fā)現(xiàn)與早期相比，晚期的ADC組織中KPNA2-波形蛋白-磷酸化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Erk)復(fù)合體水平顯著升高，表明KPNA2的過表達(dá)與癌癥侵襲和細(xì)胞遷移相關(guān)，進而表明KPNA2水平的檢測可能是一個潛在的ADC的預(yù)后標(biāo)記。Xu等[17]通過基質(zhì)輔助激光解析離子化-質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-MS)，對NSCLC切割組織進行研究，發(fā)現(xiàn)Ⅰ期NSCLC的不良預(yù)后也與波形蛋白和非肌球蛋白陽性表達(dá)相關(guān)，波形蛋白和非肌球蛋白過表達(dá)可作為判斷細(xì)胞轉(zhuǎn)移和惡性腫瘤復(fù)發(fā)的標(biāo)志。

還有研究表明，血清中CRP和血清淀粉樣蛋白A(SAA)水平的升高也可作為肺癌的預(yù)后標(biāo)記。Zhang等[18]運用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析確定，在肺癌患者的血清樣本中存在著CRP結(jié)合SAA(CRP-SAA)蛋白體。與健康對照相比，低存活率患者中CRP-SAA蛋白水平顯著升高。此外，單變量和多變量Cox分析表明，CRP-SAA可以作為一個獨立的早期肺癌患者的預(yù)后標(biāo)志。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在NSCLC靶向藥物治療中的應(yīng)用

靶向藥物治療是NSCLC的一個重要的治療手段。然而，需要根據(jù)不同患者不同分子病理情況來選擇各種敏感性和耐藥性的靶向治療方案，且藥物作用機制多與信號通路相關(guān)。

2.1 表皮生長因子受體(EGFR)為靶向的藥物治療 對于治療EGFR突變的NSCLC，酪氨酸激酶抑制劑(TKI)已經(jīng)成為一種很有前景的選擇。然而，許多患者都是從最初對EGFR-TKI產(chǎn)生反應(yīng)，到最后產(chǎn)生了抗藥性。Koch等[19]運用激酶親和純化與質(zhì)譜定量的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)在EGFR突變的NSCLC細(xì)胞中，促紅素人肝細(xì)胞受體酪氨酸激酶A2(EPHA2)表達(dá)水平高于對照的10倍以上。此外，敲除EPHA2能夠降低局部粘著斑激酶(FAK)磷酸化和細(xì)胞遷移。這表明，EPHA2的過表達(dá)與NSCLC的EGFR-TKI抗藥性相關(guān)，是產(chǎn)生EGFR-TKI耐藥性NSCLC患者的潛在藥物靶點。盡管如此，仍有30%的患者耐藥機制不清，Wang等[20]利用定量的磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)，對吉非替尼處理過的敏感和非敏感NSCLC細(xì)胞進行比較，在綜合鑒定的1 548個磷酸化蛋白和3 834個蛋白中，發(fā)現(xiàn)以CK2為核心的信號網(wǎng)絡(luò)與吉非替尼抗性相關(guān)。

和吉非替尼一樣，厄洛替尼也是常用的TKI，對NSCLC患者有很好的療效。Bosse等[21]通過細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，對厄洛替尼敏感和非敏感NSCLC細(xì)胞株進行蛋白定量分析，在900多個變化蛋白中，發(fā)現(xiàn)組織型纖溶酶原激活蛋白(tPA)、EGFR、尿基型纖溶酶原激活蛋白(uPA)、血小板源生長因子D(PDGF-D)和骨髓源生長因子(MYDGF)呈現(xiàn)顯著變化，其中tPA在厄洛替尼非敏感NSCLC細(xì)胞株中過表達(dá)，并證明了有14種蛋白質(zhì)與tPA相互作用，對NSCLC細(xì)胞厄洛替尼耐藥性的機制有了進一步的闡釋。

Pan等[22]在用伊諾肝素和吉非替尼處理NSCLC細(xì)胞的愈傷及細(xì)胞遷移的實驗中，采用了凝膠電泳和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)分裂作用因子1(DOCK1)和細(xì)胞骨架中間絲波形蛋白的表達(dá)，在細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮重要作用。綜合蛋白質(zhì)組學(xué)和通路分析顯示，DOCK1表達(dá)和波形蛋白磷酸化可以作為預(yù)測吉非替尼對NSCLC作用的潛在標(biāo)記物。可以通過伊諾肝素判斷出吉非替尼抑制腫瘤和細(xì)胞遷移的活性，主要是通過抑制DOCK1表達(dá)和波形蛋白磷酸化實現(xiàn)的。

2.2 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑為靶向的藥物治療 雷帕霉素是目前應(yīng)用最為廣泛的一種mTOR抑制劑，通過調(diào)控信號通路阻斷細(xì)胞周期、促進腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤血管生成，達(dá)到抗腫瘤的作用。但從長期療效來看，雷帕霉素的利用率低，穩(wěn)定性差。Fan等[23]利用iTRAQ標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對白藜蘆醇衍生物(TMS)處理過的H1975細(xì)胞和正常細(xì)胞進行總蛋白比較分析，發(fā)現(xiàn)78個蛋白表達(dá)上調(diào)，75個蛋白表達(dá)下調(diào)。而其中有22個蛋白與mTOR信號通路及下游核糖體生物合成相關(guān)。經(jīng)TMS處理的H1975細(xì)胞中，CaMKKβ-AMPK-mTOR通路的重要蛋白AKT、mTOR、P70S6K和S63豐度顯著下調(diào)，表明TMS具用抑制mTOR的作用，但仍需更多的臨床試驗進一步驗證。

2.3 其他信號傳導(dǎo)途徑為靶向的藥物治療 盡管EGFR抑制劑的靶向治療已經(jīng)應(yīng)用于臨床實踐中，但對于吸煙引起的癌癥患者沒有明顯的治療效果。因此，通過研究香煙煙霧誘發(fā)信號機制找到替代藥物的靶點，成了迫切需要解決的問題。通過細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記及親和富集磷酸化肽段技術(shù)，鑒定暴露在香煙煙霧中異常表達(dá)的磷酸化肽段，發(fā)現(xiàn)煙霧中H358細(xì)胞有278個磷酸位點過度表達(dá)，其中包括p21相關(guān)激酶6(PAK6)和EGFR。PAKs作為Rho GTPase蛋白的下游效應(yīng)因子，參與多種重要的細(xì)胞生命活動，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞運動和轉(zhuǎn)錄激活等[24]，而在前列腺癌、乳腺癌和肝細(xì)胞癌中，PAK6都呈現(xiàn)過度表達(dá)[25]。表明PAK6可能作為治療NSCLC特別是吸煙患癌者的潛在靶標(biāo)[26]。

Flores-Pérez等[27]在驗證沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)是否可以與順鉑產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)時，采用雙向凝膠電泳和電噴霧電離—多級質(zhì)譜技術(shù)，對NSCLC細(xì)胞的調(diào)控蛋白進行鑒別，發(fā)現(xiàn)肝癌衍生生長因子(HDGF)受到EGCG的抑制作用，呈現(xiàn)3倍以上的下調(diào)表達(dá)現(xiàn)象。這種通過EGCG減少HDGF表達(dá)的方法，能提高化療所致的細(xì)胞凋亡率，從而使NSCLC細(xì)胞對順鉑治療更加敏感，因此可以利用EGCG降低HDGF的水平，進而作為順鉑治療NSCLC患者的一個新的治療靶點。

蟾毒靈(CS-6)是蟾酥中重要的蟾二烯羥酸內(nèi)酯，在癌癥治療過程中具有代謝穩(wěn)定和副作用小的特點，又能讓NSCLC的A549細(xì)胞阻滯在G2/M期和凋亡。Zhang等[28]利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了38個CS-6作用的潛在靶點蛋白，其中31個是網(wǎng)絡(luò)互作蛋白，1個是重要的節(jié)點蛋白熱激蛋白90(HSP90)。CS-6通過與HSP90結(jié)合的ATP相互作用，抑制HSP90分子伴侶的功能，進而降低HSP90相關(guān)蛋白的表達(dá)。表明CS-6可有效抑制腫瘤生長，為NSCLC的臨床治療提供了實驗證據(jù)。

另外，幾種周期蛋白依賴性激酶4/6(CDK4/6)抑制劑應(yīng)用于臨床實驗治療NSCLC。Sumi等[29]運用無偏差質(zhì)譜化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對帕博西尼和瑞博西尼處理的肺鱗癌組織進行分析，發(fā)現(xiàn)CDK9是除CDK4/6外的另一個藥物治療靶點。此外，帕博西尼還特異與幾種脂質(zhì)激酶相互作用，其中酪蛋白激酶2和磷酸肌醇3激酶調(diào)配亞基4調(diào)控細(xì)胞凋亡，而PI-3激酶催化亞基δ和PI-5-磷酸鹽-4激酶2型A/B/C則與AKT信號傳導(dǎo)相關(guān)。表明帕博西尼作為脂質(zhì)激酶抑制劑，通過調(diào)控PI3K/AKT信號途徑促進癌細(xì)胞凋亡。

蛋白質(zhì)組對研究人類NSCLC精準(zhǔn)腫瘤學(xué)很重要。盡管最近利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定了許多NSCLC潛在的治療靶點，但在臨床應(yīng)用上還很少，因此，如何縮短蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果與臨床應(yīng)用的差距至關(guān)重要。僅研究蛋白標(biāo)記的差異表達(dá)對臨床應(yīng)用來說是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。要在綜合多種組學(xué)方法的基礎(chǔ)上，構(gòu)建人體組織蛋白質(zhì)組圖譜，從而得到蛋白質(zhì)的空間定位，直至單細(xì)胞水平[30]。定位人體全蛋白質(zhì)組的人類蛋白質(zhì)組計劃，將為研究人員提供豐富的肽段和蛋白數(shù)據(jù)庫，為診斷、預(yù)后、治療和預(yù)防醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供便利，也將為NSCLC的靶向治療提供發(fā)展平臺。

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