Necroptosis的分子機制及其在心血管疾病中的研究進展

吳玉靜，曹先通，蔡國榮，肖秀娟，李芳飛，楊志超 綜述，鄭振中△ 審校

(1.南昌大學第一附屬醫院心血管內科 330006；2.南昌大學第一附屬醫院普通外科 330006)

細胞死亡是機體發育、清除衰老受損細胞、維持內環境穩態的一個重要過程，現公認的細胞死亡方式分為“程序性死亡”和壞死。 “程序性死亡”包括凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)，是細胞按照特定信號通路進行的主動、有序的調控過程。部分壞死在特定死亡進程中可以像凋亡一樣，按照特定程序、由基因調控，這種死亡方式被命名為necroptosis[1]。

1 Necroptosis的提出

以往觀點認為壞死是細胞進行的被動、無序的死亡方式，近年來深入探索發現凋亡和壞死在很多情況下共同存在，共同參與細胞死亡進程。necroptosis是一種caspase非依賴性的死亡方式，它的死亡進程更迅速，對機體的危害更大。由于caspase活性需要一定量ATP的支持，當細胞出現炎癥、缺血損傷等情況時，能量代謝受到抑制，ATP生成不足導致caspase活性下降，機體沿necroptosis方向進展[2]。這種在凋亡受阻時由死亡受體、配基活化啟動、受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIP1)/RIP3介導、能被Nec-1特異性抑制的一類細胞死亡方式稱為necroptosis。此外發現necroptosis能被其特異性小分子抑制劑Nec-1抑制，在caspase-8缺陷的小鼠中使用凋亡特異性抑制劑z-VAD-fmk不能抑制necroptosis[3]。研究發現necroptosis介導的細胞死亡中，細胞中無凋亡小體，但可發現自噬小體，同時細胞可檢測出損傷相關模式分子(damage-associated molecular pattern molecules,DAMPs)[4]。

2 Necroptosis的分子調控機制

2.1Necroptosis通路啟動 necroptosis信號通路需要死亡受體(death receptor,DR)與配基結合啟動，現發現主要有TNF-α/TNFR1腫瘤壞死因子-α/重組人1型腫瘤壞死因子受體、Fas配基(Fas-L)/Fas、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配基(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)/TRAILR、細胞表面Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)及DNA依賴性IFN調節因子(DNA-dependent activator of IFN regulatory factors,DAI)，其中TNF-α/TNFR1是研究相對較清楚的啟動因子[5]。

在細胞信號轉導通路中，TNFR1的胞內段與沉默死亡結構域(silence of death domain,SODD)結合后構象改變，繼而與TNFR1相關死亡結構域(TNFR1-associated death domain,TRADD)結合，招募RIP、TNF受體相關因子2/5(TNF receptor associated factor,TRAF 2/5)、凋亡抑制蛋白(cellular inhibitor of apoptosis proteins,cIAP1/2)、LUBAC復合體(linear ubiquitin chain assembly complex)形成TNFR復合體Ⅰ(complex Ⅰ)發揮生物學效應[6]。

2.2RIPs家族在necroptosis中的作用及機制 RIP是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，共7個成員，該蛋白家族中含有一類高度保守的絲/蘇氨酸激酶結構域。RIP1和RIP3與細胞凋亡和necroptosis關系密切，其中RIP1是Nec-1抑制necroptosis的靶向位點。

RIP1含671個氨基酸，既可誘導細胞凋亡、necroptosis，又在TNF-NF-κB介導的細胞生存通路中起關鍵作用。RIP1由3部分組成，N端是絲/蘇氨酸激酶結構域(kinase domain,KD)，是RIPs家族成員共有的組成部分；中間是RIP同源結合基序(RIP family homotypic interaction motifs,RHIM)，C-端是與TRADD結合的死亡結構域(death domain,DD)。每個RIPs成員具有各自獨特的C-端，這樣的結構決定了它們具有不同的生物學功能，參與不同的信號轉導機制。

RIP3由518個氨基酸組成，C-端不含死亡結構域，由RHIM組成，在RIPs家族中只有RIP1和RIP3含有RHIM結構，該結構域在necroptosis調控通路中具有十分重要的作用。研究證明RIP3能使caspase-8缺陷的小鼠胚胎致死，敲除RIP3后，necroptosis進程受阻，但RIP1介導的凋亡途徑不受影響。necroptosis通路中RIP1與RIP3緊密結合形成RIP1-RIP3復合體(necrosome)并相互磷酸化是信號通路能夠正常發生的關鍵，且此現象為necroptosis獨有。此外RIP3下游信號分子混合系列蛋白激酶樣結構域(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)寡聚化和質膜轉位可能是necroptosis通路進行的關鍵[7]。

2.3Necrosome在necroptosis中的調控作用及機制 TNFR復合體Ⅰ中RIP1泛素化是決定心肌細胞存活或死亡的關鍵，第377位賴氨酸是主要泛素化位點。當RIP1被多聚泛素化時，招募轉化生長因子β激活激酶1(transforming growth factor-β activated kinase1,TAK1)、TAK結合蛋白2(TAK1-binding protein 2,TAB2)和TAB3,形成TAK1-TAB2-TAB3復合物，激活NF-κB通路介導細胞生存。在cIAPs與TAK1介導的細胞泛素化中，抑制或敲除cIAPs后RIP1泛素化受阻滯而呈現明顯的去泛素化狀態，引起心肌細胞走向凋亡或necroptosis[8]。在去泛素化酶cylindromatosis(CYLD)作用下，RIP1從TNFR復合體Ⅰ中解離釋放到細胞質，招募caspase-8、Fas死亡結構域相關蛋白(Fas-associated protein via a death domain,FADD)和TRADD形成TNFR復合體Ⅱ(complex Ⅱ)，當TNFR復合體Ⅱ中caspase-8聚集活化后，形成TNFR復合體Ⅱa，啟動經典外源性凋亡通路，同時caspase-8降解RIP1和RIP3，阻斷necroptosis進程[9]。z-VAD-fmk抑制凋亡通路或敲除caspase-8，RIP1和RIP3降解受到抑制，RIP3通過C端RHIM與RIP1結合形成RIP1-RIP3 necrosome，necrosome磷酸化激活RIP3進一步促進necroptosis進行[10]。necrosome的形成及相互磷酸化在necroptosis通路中發揮十分重要作用，Nec-1靶向作用于RIP1，抑制necrosome的形成而阻斷necroptosis進程。

2.4RIP1-RIP3-MLKL在necroptosis分子信號通路中的作用 necrosome如何激活下游信號通路，仍未完全研究清楚。研究發現，MLKL可能是RIP3激酶下游底物，necroptosis信號通路中的關鍵分子，此外還發現一種小分子物質necrosulfonamide，能夠作用于MLKL的N-端，使N-端喪失功能[6]。有研究發現RIP3和MLKL具有典型的激酶折疊，MLKL通過AMP-PNP形成非活性構象與RIP3穩定結合，在RIP3-MLKL復合體中，RIP3與MLKL各自的C-端、N-端發生改變，RIP3發生αC螺旋和活性環的顯著構象改變。MLKL的N端含有4螺旋結構域(four-helix bundle domain,4HBD)，是MLKL發揮效應的主要部分；C-端為激酶結構域，含有同源激酶序列蛋白，具有疏水性，二者通過2個α-4HBD連接，未被激活的MLKL在細胞質中以單體存在[11]。當RIP3第227位絲氨酸發生自磷酸化后，MLKL第357位蘇氨酸/358位絲氨酸位點磷酸化，引起MLKL單體發生寡聚化，寡聚后的MLKL N-端結合磷脂酰肌醇磷脂(phosphatidylinositol phosphate lipids,PIPs),C-端結合線粒體特異性心磷脂(cardiolipin,CL),使細胞質中的MLKL聚集到質膜，引起質膜轉位。MLKL單體寡聚化和質膜轉位在necroptosis進程扮演重要角色，N-端4HBD是主要功能部分，擾亂N-端功能，MLKL質膜轉位受到阻礙[12-13]。敲除MLKL后細胞對死亡敏感性下降，抑制PI(5)P或PI(4,5)P引起necroptosis進程受阻，但均不會影響凋亡通路進行。

MLKL發生質膜轉位后如何誘導necroptosis的發生發展，現仍未完全闡述清楚。現有以下幾種觀點仍存在爭論：(1)線粒體蛋白磷酸酶PGAM5(phosphoglycerate mutase family member 5，PGAM5)可能與necroptosis進程有關。MLKL與PGAM5可能是RIP3下游兩個重要信號分子，MLKL激活引起PGAM5活化并磷酸化[14-16]。在Ca2+和活性氧(ROS)的作用下形成線粒體攻擊復合物Ⅲ(mitochondrial attack complex,MAC)，同時激活動力相關蛋白Drp-1 (dynamin-related protein 1)引發線粒體裂解，線粒體裂解后ATP生成減少，引起細胞發生necroptosis，線粒體的斷裂為推動早期necroptosis進程起到重要作用；此外Drp-1激活產生大量氧自由基，直接導致細胞膜破裂、細胞器腫脹崩解，細胞走向 necroptosis進程；(2)MLKL發生寡聚化引起質膜轉位，細胞膜離子通道功能紊亂使膜內外離子平衡改變，引起細胞發生necroptosis[17]；(3)MLKL作為質膜上募集Ca2+和Na+通道的平臺發揮推動necroptosis的作用；但近期XIA等[18]發現，MLKL形成一種新型陽離子通道，對Mg2+通透性強并且允許其優先通過，對Na+和K+通透性弱，但不通透Ca2+；(4)MLKL通過N-端與PIPs結合后募集到質膜上直接作為成孔復合體發揮作用[16,19]。

2.5RIP1-RIP3-鈣/鈣調素依賴的蛋白激酶Ⅱ(Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase,CaMKⅡ)在necroptosis分子信號通路中的作用 不同于經典的RIP1-RIP3-MLKL信號通路介導的necroptosis，ZHANG等[20]發現，在心肌缺血再灌注或氧化應激中，RIP3直接磷酸化及間接氧化激活CaMKⅡ，通過PIP3-CaMKⅡ-線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)途徑介導心肌細胞程序性壞死，引起心肌損傷、惡性心室重構和心力衰竭；敲除RIP3或抑制CaMKⅡ能夠預防心肌缺氧和氧化應激引起的necroptosis,過表達RIP3促進necroptosis的發展。

3 Necroptosis與凋亡、自噬的關系

凋亡是一種caspase依賴性的細胞死亡方式，一直以來凋亡被認為是維持內環境穩態的經典死亡方式，當凋亡信號通路阻斷時，necroptosis以一種替代的形式參與細胞死亡[21]。現階段認為，necroptosis和凋亡是互補的信號通路，具有共同的啟動分子、激酶和蛋白酶，通過TNFR或TLR啟動，招募RIP1、FADD、TRADD形成復合體介導細胞死亡通路[22]。隨著研究的深入，越來越多學者發現在很多疾病中necroptosis和凋亡共同參與細胞的死亡進程。敲除RIP3或MLKL阻斷TNF-α誘導的necroptosis進程后，可以促進necroptosis向凋亡轉換，但是當RIP1的活性被抑制，這種轉換效果會減弱。使用zVAD-fmk抑制凋亡通路,caspase-8的活性被抑制，RIP1磷酸化進而促進凋亡向necroptosis的轉換。

自噬是一種具有自我更新和自我保護機制的細胞死亡方式，能夠調節細胞內成分的降解，對維持體內平衡起至關重要的作用。自噬可以通過降解細胞內過剩的蛋白質和受損的細胞器維持機體穩態，適度的自噬可保護細胞免受環境刺激的影響，但是當自噬被過度激活或抑制時，介導損傷性作用將導致疾病[23]。OBERST等[24]認為招募FASS與自噬體結合可以直接激活RIP1和RIP3。在TNF-α或饑餓狀態下介導的自噬可以抑制necroptosis，敲除RIP1或用Nec-1可以抑制自噬信號通路的進程。這些結果顯示，自噬本身可能并不會誘導細胞死亡，它可能是necroptosis的下游信號通路。然而部分研究者認為，自噬并不僅僅可以介導細胞生存，其本身也會誘導細胞死亡。OSBORN等[25]發現FADD缺陷的T細胞增殖介導的necroptosis并不會影響自噬，提示自噬并不是necroptosis通路中的一部分，自噬與necroptosis是兩種完全獨立的細胞死亡方式。因此對于自噬與necroptosis的關系，至今依然沒有確切的定論。

截至目前，對于necroptosis與凋亡和自噬這3種細胞死亡方式之間的相互關系及具體的信號分子機制依然未闡述清楚，需要更多的研究來探索。

4 Necroptosis在心血管疾病中的研究進展

在鼠心肌缺血再灌注模型中發現，給予一定劑量Nec-1能夠使缺血再灌注急性期的心肌損傷明顯減小，慢性期心肌纖維化減弱，梗死灶體積與對照組相比明顯縮小。在缺氧誘導的心肌缺血損傷中，使用抑制劑Nec-1，凋亡信號通路caspase-3表達相對增加；使用凋亡抑制劑z-VAD-fmk，necroptosis信號通路RIP3表達量增加。通過大量研究發現在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)模型中凋亡占據了重要的地位，其中線粒體通路研究相對較充分，而TNF-α死亡受體通路證據較少。后期通過不斷研究證實在大鼠AMI模型中有necroptosis信號通路RIP1、RIP3蛋白表達，提示心肌細胞的死亡方式不僅只有凋亡與自噬，necroptosis也發揮了作用，并且在一定條件下necroptosis與凋亡共同存在且相互轉化。有文獻報道在病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)中發現了凋亡和自噬，但使用caspase抑制劑處理病毒感染的心肌細胞發現，心肌細胞的死亡進程加快，具體機制目前仍不清楚。

通過不斷深入研究，necroptosis參與包括感染和炎癥性疾病、動脈粥樣硬化、腦缺血性疾病等疾病進程，近年來necroptosis在急性心肌缺血再灌注損傷及心力衰竭中的作用受到廣泛重視，使用Nec-1能夠明顯減弱心肌損傷。在心肌炎或心瓣膜病等其他心血管疾病中是否也存在necroptosis?具體信號調控機制是什么?阻止進程能否保護心肌細胞?這些問題至今還沒有確切定論。隨著necroptosis研究的日益深入，其機制的探索也取得了一定進展，其將有望為研究心肌細胞壞死的病理機制、治療方向及干預措施提供新的突破口。