纖維素降解菌復合菌系的構建及產酶研究

雷湘蘭 孫倩 沈振國 唐滇

摘 要：本研究利用從紅樹林土壤中分離、篩選得到椰糠纖維素高效降解菌，通過菌株間拮抗研究和濾紙條降解研究，構建和篩選出具有高效降解椰糠纖維素能力的優選復合菌系，通過對優選復合菌系的產酶條件的研究，確認了其產酶的最佳條件。結果表明：優選復合菌系Z-10 / B-05的纖維素降解能力優于單一菌株，其產酶最佳條件是：培養溫度35℃，培養液初始pH值6.5，培養時間5d。在優選產酶條件下，復合菌系Z-10 / B-05對椰糠、秸稈均有較好的降解效果，椰糠降解率達到36.1%。

關鍵詞：纖維素降解；復合菌系；產酶條件

中圖分類號：Q539+3 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180329003

纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，也是一種可再生有機資源，但秸稈、椰糠等纖維素類物質較難被分解，常被焚燒或廢棄，既污染生態環境，又浪費資源。因此，提高對纖維素類物質的利用，篩選建立高效降解纖維素的菌株和菌系，具有重要意義[1-4]。

本研究利用從紅樹林中分離、篩選出的具有高效降解椰糠纖維素能力的菌株，構建了復合菌系Z-10 / B-05。通過對優選復合菌系產酶條件及對不同類別纖維素發酵效果的初步研究，為纖維素的資源化利用提供菌種資源和開發參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

菌種：細菌B-05、B-09、B-13；霉菌Z-10、Z-14、Z-20，均為從紅樹林中分離、篩選出的具有高效降解纖維素能力的菌株，由海南職業技術學院熱帶農業技術學院實驗室保藏。

培養基：羧甲基纖維素鈉培養基：CMC-Na 15.0g，磷酸二氫鉀1.5g，氯化鈉0.5g，硫酸鎂0.3g，蛋白胨10.0g，蒸餾水1000 mL，瓊脂18.0g，pH 6.8。

濾紙條培養基：硫酸銨1.0g，酵母粉0.1g，磷酸二氫鉀1.0g，硫酸鎂0.3g，磷酸氫二鉀2.0g，濾紙條（1cm×6cm），蒸餾水1000 mL。

發酵培養基：椰糠粉10.0g，酵母粉5.0g，氯化鈉5.0g，磷酸二氫鉀1.0g，硫酸鎂0.2g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，蒸餾水1000 mL，pH 6.8。

椰糠液體培養基：椰糠粉5g，氯化鈉5.0g，硫酸鎂0.1g，磷酸二氫鉀1.0g，葡萄糖1.0g，硫酸銨2.0g，蒸餾水1000 mL，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 拮抗實驗

按參照文獻[5]的實驗方法。

1.2.2 復合菌系構建方法

將菌株按細菌霉菌兩兩組合，分別接種到裝有100mL發酵培養基的250mL三角瓶中，110 r/min，35℃±1℃恒溫培養14d，觀察濾紙條降解情況。

1.2.3 產酶活性研究

纖維素酶活力（ CMC 酶活）測定參照文獻[6]實驗方法

1.2.4 復合菌系產酶條件研究

1.2.4.1 培養溫度的影響

將復合菌系接種到裝有100mL發酵培養基的250mL三角瓶中，分別置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃條件下，110 r/min，培養5d后，取樣測定其纖維素酶活力（ CMC 酶活）。

1.2.4.2 起始pH的影響

將復合菌系分別接種到起始pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的裝有00mL發酵培養基的250mL三角瓶中。110 r/min，35℃±1℃，培養5d后，取樣測定其纖維素酶活力（ CMC 酶活）。

1.2.4.3 培養時間的影響

將復合菌系接種到裝有100mL發酵培養基的250mL三角瓶中，35℃±1℃，110 r/min，培養7d，每24h取樣測定其纖維素酶活力（ CMC 酶活）。

1.2.5 復合菌系發酵實驗

使用椰糠液體培養基時，分別用玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈替代椰糠，作為碳源。將優選復合菌系接種到液體培養基，保持條件不變，在35℃±1℃、發酵6d，研究優選復合菌系對其降解效果。

2 結果與分析

2.1 復合菌系的構建結果

2.1.1 菌株間拮抗研究

拮抗試驗結果顯示，兩兩組合的菌株未發現顯著拮抗作用。

2.1.2 維素降解復合菌系的構建

將細菌B-05、B-09、B-13與霉菌Z-10、Z-14、Z-20，分別混合發酵，構建纖維素降解菌系。由表1結果可知：霉菌Z-10和B-05在降解纖維素方面存在比較明顯的協同作用，菌株Z14、Z-20與B-09、B-13雖無明顯拮抗，但對濾紙的降解效果不理想。菌系Z-10 + B-05組合對濾紙的降解效果最優，具有良好的應用潛力，作為優選復合菌系。

2.2 復合菌系產酶條件研究

2.2.1 培養溫度的影響

圖1顯示，當溫度為35℃時，優選復合菌系的酶活力大最大73.9 U/mL。超過40℃后，優選復合菌系的產酶能力下降顯著。當溫度在35℃之前時，則優選復合菌系的酶活隨溫度的升高而增大。

2.2.2 起始pH的影響

圖2顯示，pH6.5，優選復合菌系產生的酶活最高，CMC為79.7 U/mL。優選復合菌系在中性和弱酸性條件下均表現出較好的酶活性。在堿性條件下，其酶活呈明顯下降趨勢。

2.2.3 培養時間的影響

圖3顯示，發酵培養2～7d時，優選復合菌系產酶處于較高水平。5d時，酶活達到最大值83.7U/mL。超過6d，酶活力逐漸下降。

2.3 纖維素降解菌復合菌系發酵實驗

優選復合菌系對不同類別纖維素發酵6d時的降解率見表2。

表2顯示，優選復合菌系對椰糠、秸稈類纖維素具有高效降解作用。其中，對椰糠的降解轉化率最高，降解率達到36.1% 。

3 結語

本研究構建的高效降解纖維素的最優復合菌系Z-10 + B-05，其產酶最佳條件：培養溫度35℃，培養液初始pH值6.5，培養時間5d。在該優化條件下，優選復合菌系對椰糠、秸稈類纖維素，表現出較高的降解能力，具有的應用潛力，并為下一步研究提供了菌種資源和基礎資料。

優選復合菌系產生的纖維素降解酶系及作用機制等尚完全明確，有待進一步研究和探討。

參考文獻

[1]何雋菁.纖維素酶的研究應用新進展[J].科技資訊，2006（32）：7.

[2]趙琪，李亞蘭，陳子欣，等.纖維素酶應用研究的最新進展[J].廣州化工，2014（6）：21-23.

[3]范力敏，季萍，陳曉湘，等.轉化纖維素資源生成酒精的研究 [J].環境科學學報，1990，10（3）：356-358.

作者簡介：雷湘蘭（1980-），女，講師，碩士，研究方向：食品微生物、食品加工；沈振國（1982-），男，講師，碩士，研究方向：應用生物技術。