24味中草藥對舌鰨源嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果

王洪彬 ，李永慧 ，朱利霞 ，吳同壘 ，張志強 ，高桂生 ，史秋梅

（1.河北科技師范學院動物科技學院，河北省預防獸醫學重點實驗室，河北 秦皇島 066604；2.秦皇島第二醫院，河北 秦皇島 066604）

舌鰨Cynoglossus sp.營養豐富，肉質細膩、味道鮮美，廣受消費者喜愛，是名貴的海水養殖魚類之一。隨著海水養殖舌鰨規模的擴大，各種細菌性疾病也隨之而來，其中由嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila引起的細菌病最為嚴重。嗜水氣單胞菌是一種常見的條件致病菌[1,2]，能夠引起多種淡水魚、蛙、哺乳動物以及海水養殖魚類的敗血癥、皮膚潰瘍、腹瀉等疾病[3]。有資料顯示，該菌還是一種嚴重的“人-畜-魚”共患菌[4]，研究該菌具有重要的公共衛生學意義。

近年來，由于魚類養殖中大量使用、濫用抗生素和化學藥物，導致水體養殖環境惡化，也產生了耐藥性菌株，水產養殖魚類免疫力下降，抗病能力減弱，甚至嚴重威脅人類的健康和食品安全。中草藥取材方便、價格低廉，含多種生物活性物質，如有機酸類、生物堿類等，可調節水產養殖魚類的免疫力，能夠增強魚類的抗菌、抗病能力等[5]，越來越被人們所接受。從中草藥中篩選出具有更強抗菌能力的藥物受到了極大的重視[6]。本試驗選取板藍根、連翹、訶子等24味中草藥，采用水提法提取中藥材有效成分，測定這24味中草藥水提物對舌鰨源嗜水氣單胞菌的抑菌效果，為進一步篩選出具有明顯抑菌作用的中草藥和臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株：舌鰨源嗜水氣單胞菌為本實驗室提供，編號為A.H QHD-1。

24種中草藥是：訶子、蘇木、艾葉、石榴皮、厚樸、蒲公英、馬齒莧、知母、決明子、桔梗、龍膽草、青皮、苦參、郁金香、香附、防風、荊芥、黃柏、連翹、黃芩、夏枯草、紫花地丁、板藍根和女貞子，購自秦皇島民樂醫藥。營養瓊脂、營養肉湯培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司。

試驗儀器有：G1040WS-立式自動壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；無菌工作臺，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；冰箱，青島海爾特種電冰箱有限公司；隔水式恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；常規試劑與儀器均等由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗菌株菌液的制備

從-80℃冰箱中取出舌鰨源嗜水氣單胞菌，接種于普通的營養瓊脂培養基上，28℃培養過夜。無菌挑取嗜水氣單胞菌單個菌落，接種于含有4mL營養肉湯的試管培養基中，置于28℃180r/min搖床，搖菌12h。用平板菌落計數法確定菌液濃度，使菌液最終稀釋至1×108cfu/mL。

1.2.2 單味中草藥藥液制備

根據參考文獻[7]中報道的水提法，并略加改動，提取連翹、知母、訶子等24味中草藥有效成分。先稱取定量的中草藥原料，除去雜質，清洗，干燥。粉碎后，每種中草藥稱取40g倒入燒杯中，加入400mL水浸泡1h。然后煎煮，邊煮邊攪拌，連煮2次，冷卻并過濾，離心后濃縮至40mL，使藥液終濃度為1g/mL，分裝后121℃滅菌10min，分裝并置于4℃冰箱中保存備用。

表1 中草藥對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果Tab.1 The in vitro bacteriostatic effects of Chinese herbal medicines on Aeromonas hydrophila

1.2.3 中草藥體外抑菌圈直徑的測定

[8]中的瓊脂平板打孔法測定。抑菌圈直徑≥20mm為極敏，20mm＞抑菌直徑≥15mm為高敏，15mm＞抑菌圈直徑≥10mm為中敏，10mm以下為低敏[9]。

1.2.4 中草藥最小抑菌濃度（MIC）的測定

按參考文獻[10]略加改動，用試管二倍稀釋法測定MIC。先將11只試管標號1～11，每管加入2mL 2×的營養肉湯；在第2個管中加入2mL的藥液（1g/mL），混合均勻后吸取2mL到第3管里，依次重復直到第9管，從第9管吸取2mL到第11管混合均勻后棄去2mL，第10管不加藥作為陽性對照；第1～10管各加入10μL菌液（菌液濃度1×108cfu/mL），第11管不接菌為陰性對照。每種藥物3個重復，28℃培養24h。利用平板分區劃線法，無菌棉簽蘸取不同稀釋度的培養液涂板，28℃培養12h后觀察結果。無菌生長時的藥物濃度為該藥的MIC。

表2 不同中草藥對嗜水氣單胞菌的MICTab.2 The minimum inhibitory concentration （MIC）of different Chinese herbal medicines on Aeromonas hydrophila

2 結果與分析

由表1可知：舌鰨源嗜水氣單胞菌對訶子、蘇木、夏枯草、青皮這4種中草藥極敏感；對黃芩、板藍根、厚樸、紫花地丁高度敏感；對女貞子、苦參、荊芥中度敏感；對黃柏、龍膽草、知母、防風、決明子、郁金香、馬齒莧、艾葉、石榴皮、桔梗低敏感。建議在水產養殖中聯合使用訶子和青皮，以達到更好的治療效果。

由表2可知：訶子和夏枯草對舌鰨源嗜水氣單胞菌的MIC為31.25mg/mL,；蘇木、青皮對該菌的MIC為62.5 mg/mL；紫花地丁、厚樸對該菌的MIC為125 mg/mL；黃芩、板藍根、女貞子、蒲公英對該菌的MIC為250 mg/mL；香附、苦參、荊芥對該菌的MIC為500 mg/mL；黃柏、龍膽草等中草藥沒有抑菌效果。每味中草藥對舌鰨嗜水氣單胞菌的MIC不同，生產中可以據此合理調整，減少藥物的濫用和浪費，提高經濟效益。

3 討論

近年來，嗜水氣單胞菌等造成的海水養殖細菌病逐年增加，大都采用抗生素治療這些細菌性疾病[11]。抗生素防控了病原菌感染，也導致了耐藥菌株的出現[12]。1957年美國首次觀察到耐磺胺藥物殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida，該菌引起了虹鱒的大規模感染、死亡；1971年在日本大麻哈魚Oncorhynchus keta體內檢測到耐磺胺藥物和氯霉素的殺鮭氣單胞菌；20世紀80年代末，多重耐藥性嗜水氣單胞菌的出現導致淡水魚患嚴重的細菌性敗血癥在全國范圍內流行，都表明了多種致病菌產生了單一或者多重耐藥性[13]。此外，抗生素在水產品中高殘留，導致接觸人體耐藥菌增加，耐藥性逐漸增強。總之，抗生素以及化學藥物的濫用、誤用等造成了海水養殖環境的惡化；大量致病性耐藥菌株的出現，使水產養殖業遭受巨大經濟損失；食品中抗生素高殘留，極大威脅了人類的健康。

中草藥具有特殊的抗病原微生物機制，治療細菌性疾病效果較好[14]。研究表明，中草藥主要通過調動機體內的積極因素來減弱細菌對組織的破壞以及降低細菌毒力等方式來發揮抑菌作用[14]。如豬苓、黃芪等中草藥可以提高外周血淋巴細胞的轉化率、增加雞淋巴細胞花環的形成等。然而，部分中草藥的抗菌機制主要通過對菌體直接發揮作用而達到抑菌和殺菌作用，如大蒜分子中含有的氧原子可與半胱氨酸分子中細菌生長繁殖所必需的巰基結合，使巰基變成了非活性物質，極大抑制了細菌的生長繁殖。

相關文獻顯示，中草藥防治嗜水氣單胞菌性細菌病比抗生素具有明顯的獨特優勢[15]。中草藥是中國醫學瑰寶，是提高防病治病水平、增加經濟效益以及發展綠色水產養殖業和人類健康的需要[5,16]；中草藥具有抗菌、抗病作用，如黃芩、黃柏等能夠抗菌、調節機體自身免疫，增強免疫力等[17,18]；中草藥無藥殘、抗藥性不顯著、來源廣泛、無公害等，應用中草藥防治魚病越來越引起科研工作者的關注[16]。黃岑、訶子具有廣泛的抑菌譜，應用廣泛。這兩種中草藥對大腸桿菌Escherichia coli、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa均有一定的抑菌作用[19]，本試驗也顯示嗜水氣單胞菌對這兩種中藥極為敏感，其中訶子對嗜水氣單胞菌的抑菌作用最強，這與陶健等[15]、羅新等[20]的研究結果一致。訶子內含有糖類、多種氧化酶等，具有廣泛的藥理作用。厚樸多用于臨床治療細菌性疾病、炎癥等，在傳統醫學、日本漢方醫學已經得到廣泛的應用[20]。嗜水氣氣胞菌對連翹表現耐藥，這與陳曉利等[10]試驗結果不同，其主要原因可能在于菌株分離、來源地、基因以及中草藥煎煮方法等不同。本研究選取“人-畜-魚”共患-嗜水氣單胞菌，進行體外抑菌試驗，旨在篩選出對嗜水氣單胞菌有較強抑制作用的中草藥，為中草藥臨床治療由嗜水氣單胞菌引起的細菌病提供了重要理論參考。中草藥成分復雜，有效成分和抗菌機制、作用機理有待進一步研究。

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