超聲處理大豆分離蛋白與肌原纖維蛋白共混體系乳化性及凝膠性研究

江連洲，張瀟元，潘 悅，李 楊，齊寶坤，綦欣玉，魏嘉禹，王莉涵，王中江

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

大豆分離蛋白(SPI)是一種營養豐富的植物蛋白，其具有的良好功能特性使大豆蛋白在食品工業中得到了廣泛的發展與應用[1]。肌原纖維蛋白(Myofibrillar protein，MP)是由多種蛋白形成的復合體，包括肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白和調節蛋白等。近幾年來，隨著大豆蛋白經濟價值與功能特性研究的不斷深入，以及消費者對肉制品健康需求的增加，大豆分離蛋白已廣泛應用于肉制品中。然而，由于低變性SPI的變性溫度通常比低溫肉制品常規加熱溫度低，極大阻礙了SPI與MP之間的交互作用，導致SPI對MP乳化性與凝膠性的積極作用不明顯。因此，國內外學者開始研究改性后SPI對MP功能性質的影響，發現經過改性的SPI可以不同程度提高MP的功能性質。Feng等[2-4]曾報道經熱處理后的SPI能夠顯著提高肌纖維蛋白凝膠的彈性和強度，但未經加熱的天然SPI對肉凝膠沒有較大貢獻。歐陽艷華等[5]研究了經酶改性的SPI與雞肉MP復配后的乳化性和凝膠性，結果表明，混合蛋白的凝膠性和乳化性明顯改善。

本文系統探討了經不同超聲處理的SPI與MP復合體系的乳化性、流變特征及熱誘導凝膠的質構性、持水性和作用力，并對其微觀結構進行觀察。其目的在于討論經過怎樣處理的大豆分離蛋白有利于肉蛋白的凝膠特性，從而應用于實際低溫肉制品體系中，得以提高大豆分離蛋白在肉制品中的合理應用，提高肉制品品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背部最長肌，哈爾濱家樂福超市；大豆分離蛋白(蛋白含量89.21%)，山東省高唐藍山集團；十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇，美國Sigma公司；葵花籽油，中糧集團福臨門；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，分析純試劑。

1.2 主要儀器設備

T18型高速分散機，德國IKA公司；Scientz-IID型超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；ALC-310.3型分析天平，德國艾科勒ACCULAB公司；PHSJ-4A型實驗室pH計，中國上海雷磁公司；AR2000流變儀，英國TA Instrument公司；TA-XT Plus質構儀，英國Stable Micro Systems公司。

1.3 試驗方法

1.3.1大豆分離蛋白的超聲處理 實驗室提取的大豆分離蛋白用20倍體積的水復溶，pH調節到7.0，將超聲探頭浸入SPI溶液液面以下2cm并位于液面中間，同時將盛放樣品的燒杯置于冰水浴中，在20 Hz選定超聲處理時間和功率進行超聲處理(附表)，每超聲5 s，停止超聲5 s，冷凍干燥后得到超聲處理大豆分離蛋白。

附表 超聲處理方法

1.3.2復合蛋白凝膠的制備 MP∶SPI=4∶1(W/W)，溶解在0.6mol/L NaCl、50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中，總蛋白濃度為40mg/mL，室溫下攪拌90min，即得MP-SPI復合蛋白。復合蛋白在80℃條件下水浴30min制備凝膠，4℃隔夜。

1.3.3乳化性測定 用0.1mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制100mL、0.1g/mL的混合蛋白懸浮液，其中，MP∶SPI=4∶1(W/W)。向勻漿機中加入30mL蛋白懸浮液、10mL葵花籽油，在20 000r/min的條件下得到乳濁液，在0min與10min時從底部吸取100μL加入10mL質量濃度為0.1g/mL的SDS溶液中，測定波長為500nm時的吸光度(取3次測定的平均值)，乳化性的計算公式為式(1)、(2)：

乳化活性(EAI)=A0×100

(1)

乳化穩定性(ESI)=(A10/A0)×100

(2)

式(1)、(2)中，A0：0min的吸光值；A10：10min 的吸光值

1.3.4凝膠質構性的測定 將制備的復合蛋白凝膠在4℃冰箱中過夜后，利用質構儀測定凝膠硬度，測試前先將凝膠在25℃條件下水浴1 h。設定的主要參數是：探頭類型為P/0.5、測前速度為1.0mm/s、測定速度0.5mm/s、測定距離為5.0mm、測后速度為1.0mm/s、觸發類型為自動、觸發力為5g，數據獲得速度為200pps。

1.3.5凝膠持水性的測定 制備的復合蛋白凝膠在 4℃冰箱中過夜后，取凝膠塊放入50mL的離心管中，離心(10 000g、15min、4℃)。除去水后，將離心管倒放在鋪有吸水毛巾的桌面上，15min后稱重[6-7]。

(3)

1.3.6流變性的測定 流變學性質測定采用剪切速率掃描模式[8]。將經過不同方式制備的大豆蛋白-磷脂酰膽堿納米乳液加到流變儀平板上，流變儀平板直徑為40mm，探頭型號及尺寸：pp為20mm、板間距為0.5mm。采用石蠟油對兩平行板間的縫隙封口，防止水分蒸發。測定參數：初始溫度25℃，以5℃/min升溫速率升溫至90℃后保溫20min，之后以5℃/min降溫速率降溫至25℃。角頻率為0.63 rad/s，固定形變0.01，記錄下彈性模量G′數值的變化。

1.3.7化學作用力的測定 復合蛋白凝膠的作用力根據Jiang等[9]的方法進行測定。2g凝膠樣品溶解在18mL不同的溶解液中，然后將混合溶液于80℃加熱30min，冷卻到室溫，5 000g離心15min。經溶解液處理后提取的蛋白含量被用來表明凝膠中的主要作用力。溶解液如下：8mol/L尿素、50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)(氫鍵)；0.5% SDS、50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)(疏水交互作用)；0.25% β-巰基乙醇、50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)(二硫鍵)。

1.3.8掃描電鏡 將真空冷凍干燥后的粉末充氮氣密封、避光儲藏，測量時首先用導電雙面膠將凍干粉末固定在金屬樣品平臺上，輕吹去多余的粉末，置于離子濺射儀的樣品艙中，在15mA的電流下噴金90 s，樣品取出后，裝入掃描電子顯微鏡(15 kV)觀察室，進行觀察。

1.4 數據統計及分析

單項實驗重復3次。用SAS 8.12進行差異顯著性(P<0.05)分析。采用Origin9.1軟件進行圖表處理。

2 結果與討論

2.1 超聲處理復合蛋白體系乳化性

如圖1和2所示，與天然SPI與MP復合體系乳化性(EAI 8.97m2/g，ESI 66.7%)相比，經超聲處理后的SPI與MP復合體系乳化性顯著提高。而且經高功率、長時處理的SPI與MP復合體系乳化性最好，乳化活性和乳化穩定性分別為18.25m2/g和78.88%。

超聲波能產生空穴效應、機械剪切作用以及熱作用，能夠破壞大豆分離蛋白分子中維持高級結構的次級鍵，使肽鏈變得疏松，在復合蛋白乳化均質過程中，利于吸附在油—水界面，提高SPI的溶解度[10-11]，促進了其與MP能更好地溶解在緩沖液中，提高蛋白質—水之間的作用，提高復合體系的乳化性。另外，SPI經超聲處理使更多疏水基團暴露，降低SPI表面張力，在與MP復合乳化均質過程中，使更多的蛋白質吸附在氣/水界面上，降低蛋白膜的粘性度和剛性，提高乳化活性。SPI經超聲處理后，蛋白質三級結構會被破壞掉，這有助于形成足夠的界面來穩定油滴，所以MP與SPI復合體系的乳化穩定性增強[12]。

2.2 超聲處理復合蛋白體系質構性

圖3和圖4表明，SPI經超聲處理后能夠改善SPI與MP復合凝膠的硬度和彈性，且經高功率超聲處理的SPI與MP復合凝膠硬度及彈性值提高顯著(P<0.05)。與MP-NSPI凝膠相比，凝膠2～5號樣品的硬度分別提高了3.1%、8%、17.6%和21.5%，彈性的變化趨勢與硬度的變化趨勢相同，其中經功率400 W、超聲20min的SPI與MP凝膠的彈性最大，為0.88mm。

超聲波通過在固體顆粒的表面產生高速微射流，對固體顆粒表面進行剝離、凹蝕和粉碎，從而產生新的活性表面，提高蛋白質表面的親水性[13]。SPI經超聲處理后，疏水肽的分子數目增多，疏水基團暴露增加了蛋白質的疏水部分，促進膠束的形成[14]，進而影響MP與SPI復合凝膠的凝膠性。超聲功率增加后聲能密度增大及聲能轉化為更多的化學能和物理能，SPI受機械剪切、攪拌空化作用增強。增加超聲功率還會加快大豆蛋白構型的破壞，蛋白分子展開暴露出更多的疏水基團，進而提高了蛋白質的表面疏水性，降低了表面張力。這樣，蛋白質—水之間的相互作用及蛋白質—蛋白質之間的交聯作用增強，將間隙中的水分鎖定在凝膠體系的同時網絡結構會更加緊密，從而提高了SPI與MP復合凝膠的硬度及彈性。

2.3 超聲處理復合蛋白體系持水性

如圖5所示，超聲處理后的SPI與MP復合凝膠持水性顯著提高(P<0.05)。與天然SPI與MP復合凝膠持水性53.68%相比，MP-USPI(200W、10min)、MP-USPI(200W、20min)、MP-USPI(400W、10min)和MP-USPI(400W、20min)凝膠，持水性分別提高了6.91%、11.96%、23.69%和28.05%。這可能是因為SPI經超聲處理后，能顯著提高大豆分離蛋白的溶解性[15-16]。MP也是鹽溶蛋白，SPI溶解性提高，使得溶解于溶劑中的總蛋白含量提高，加強蛋白質—蛋白質、蛋白質—水之間的作用，熱誘導凝膠形成過程中能形成比較均勻的凝膠結構。已有研究表明，凝膠的微觀結構與凝膠持水性密切相關。通常情況下蛋白質疏水區域一般在蛋白質分子內部，超聲處理的SPI能將各種疏水基團接到蛋白質分子上，進而導致蛋白質的三級結構發生改變，形成可溶性蛋白聚集物，粒度及不溶蛋白的聚合程度降低。在MP與SPI復合蛋白凝膠形成過程中，SPI粒度的減小有益于產生更多蛋白質-水之間的相互作用，提高復合蛋白凝膠的持水性。

2.4 超聲處理復合蛋白體系流變性

由圖6可知，隨著溫度的上升(20～80℃)，所有經過超聲處理的SPI與MP混合蛋白的彈性模量G’明顯高于未經超聲處理的SPI與MP復合體系的彈性模量G’。在超聲作用下，微流束作用和空穴效應促使分子運動速度加快，降低蛋白聚集程度，使SPI分子鏈展開，進而改變MP-SPI的流變性。

由圖6可見，G’的變化呈現出雙峰值，代表熱誘導凝膠形成過程中經歷兩個熱變性階段，其中一個組分先發生變性，另一個組分需要在更高的溫度下才發生變性[17]。有學者對稀溶液中肌球蛋白分子的熱誘導凝膠形成機制進行了研究，認為熱誘導凝膠的形成機制是肌球蛋白分子的頭—頭的凝聚、頭—尾的凝聚和尾—尾的凝聚[18]，因此就會引起兩個峰值的出現。結果還表明，SPI經高功率超聲處理后與MP復合最終的G’增加值更大，這可能是因為聲能密度增大，并且能將聲能轉化為更多的化學能和物理能，SPI受機械剪切、攪拌空化作用增強，使得SPI變性程度越大，與MP能形成更好的凝膠，因此儲能模量G’越大。此外，高功率超聲處理使蛋白分子展開，暴露更多的疏水基團，能夠提高SPI的表面疏水性，增強SPI與MP之間的疏水交互作用，使彈性增加，表現為高的G’值。

2.5 超聲處理復合體系凝膠形成過程中的作用力

由圖7可知，經β-巰基乙醇溶解后的蛋白含量無顯著變化，經尿素和SDS溶解后的蛋白含量隨著超聲功率和超聲時間的提高發生顯著變化(P<0.05)，并且還發現高功率的影響更為顯著。說明經超聲處理的SPI對復合凝膠的二硫鍵影響不顯著，但對復合凝膠的氫鍵和疏水作用影響顯著。還可發現，不論是未超聲的SPI與MP的復合凝膠，還是經超聲處理的SPI與MP復合凝膠，氫鍵和疏水交互作用都是穩定/形成凝膠最重要的力，二硫鍵也參與凝膠的形成，但不是穩定/形成凝膠最主要的力。為此可以推斷不論超聲與否，疏水交互作用、氫鍵和二硫鍵都對SPI與MP凝膠結構的維系起了作用，并且疏水交互作用和氫鍵作用遠高于二硫鍵的作用。

超聲作用將疏水基團暴露至蛋白表面[19]，疏水相互作用在凝膠的形成過程中起重要作用[20]，特別是在熱聚集的時候能夠形成更好的蛋白-蛋白聚合物，提高SPI與MP的交互作用，表現為疏水交互作用的增強。Tian等[21]推斷超聲處理產生的空穴效應能增大水和空氣之間的間距，從而使蛋白分子環境發生變化，降低氫鍵和疏水相互作用。本文SPI經超聲空穴效應可能也會削弱氫鍵和疏水相互作用。SPI分子內/間氫鍵的減少，在隨后的熱誘導MP-SPI形成過程中，會繼續減少，表現為用尿素提取的蛋白含量減少。而SPI疏水交互作用的減弱，能引起大豆分離蛋白溶液的游離巰基含量、表面疏水性和溶解性的增加，這會引起MP與SPI疏水交互作用的增強，使經SDS提取的蛋白含量顯著提高。SPI蛋白分子間的非共價作用減少可能轉化為靜電相互作用，從而影響MP-SPI凝膠的持水性。已有研究表明，超聲波導致溶解性和表面疏水性同時增加的現象，可能是蛋白粒度減小、其他分子相互作用力減弱的結果[22]。

2.6 超聲處理復合體系凝膠觀結構觀察

通過對超聲處理的SPI與MP復合蛋白凝膠掃描電鏡圖8觀察發現，經過超聲波處理的凝膠空間結構與未處理的樣品有顯著差異。MP-NSPI凝膠(圖a)的SPI呈不規則形狀充填在混合體系中，凝膠結構粗糙，有明顯的斷層感，沒有發現明顯的交聯。經200W超聲的SPI與MP復合凝膠(圖b和c)能看到交聯現象，生成了不規則、大的孔洞。經高場強超聲的SPI與MP復合凝膠(圖d和e)能觀察到明顯的粗絲、細絲交聯現象，結構變得更加致密和均勻，不規則的孔洞變小。蛋白分子的大小和形狀能影響凝膠的微觀結構[23]，SPI經超聲作用會減小其粒度，增強蛋白質—蛋白質的相互作用，影響最終MP-SPI復合凝膠的微觀結構。而且超聲導致可溶性蛋白聚合物的形成[24]，這種可溶性蛋白聚合物，在形成熱凝膠時可能轉變為難溶蛋白聚合物并有利于與MP通過疏水交互結合，起到使空間結構更加均一、致密的作用。Madadlou等[25]指出蛋白粒徑減小后，再發生聚合可以使結合更緊密，空間結構更穩定，凝膠質構性更強。

3 結論

通過對超聲處理MP-SPI復合體系乳化性質、凝膠性(持水性、流變性、質構性)的測定并對凝膠微觀結構進行觀察可知：SPI經過10/20min、200/400 W超聲處理后會影響MP-SPI復合體系的乳化性、凝膠性。其中MP-USPI(400W、20min)復合體系乳化性及凝膠性最好，EAI和ESI分別為18.25m2/g 和78.88%；持水性提高了28.05%；硬度提高了21.5%；彈性為0.88mm。凝膠結構變得致密、均勻，不規則孔洞變小。隨著SPI變性程度的升高，氫鍵都有下降趨勢，疏水交互作用增加，二硫鍵變化不顯著。◇

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