磁性熒光納米球的制備及其對細胞的識別和捕獲

溫聰穎,杜正坤,吳玲玲

(1.中國石油大學(華東) 理學院,山東 青島 266580； 2.武漢大學 教育部生物醫學分析化學重點實驗室,湖北 武漢 430072)

21世紀是生命科學的世紀,生物化學對社會的發展起著重要的作用[1-2],生物化學已經成為生命科學學院、化學院、醫學院等開設的重要專業課程,其中實驗教學在學生理解和掌握生物化學知識以及對學生的創新能力培養方面起著舉足輕重的作用[3-5]。傳統的實驗教學是學生按照教科書提供的實驗方案,在教師的指導下完成實驗,有助于培養學生的基本實驗技能，但實驗內容與科研前沿聯系較少,學生的創新實踐能力和綜合能力不能得到很好的鍛煉[5-6]。生物化學是一門前沿性學科,為了加強學生掌握前沿知識和從事科學研究能力的培養,通過實驗教學向學生展示生物化學的前沿進展已經成為緊迫而艱巨的任務[6-7]。

1 量子點和磁性納米顆粒簡介

隨著納米科技的迅速發展,越來越多的納米材料應用于生物化學研究,基于量子點和磁性納米顆粒的功能材料展現出傳統材料所無法比擬的優良性質[8-10]。量子點是尺寸接近或小于激子波爾半徑的半導體納米晶,主要由II-VI族元素或者III-V族元素組成,是一種新型的熒光材料,具有寬激發窄發射、一元激發多元發射、發射波長隨尺寸和組成可調、熒光強、耐光漂等特點,已經被廣泛應用于生物檢測、生物成像、動態示蹤等領域[11-13]。磁性納米顆粒指的是含鐵、鉑、鈷或者它們的合金及其氧化物的納米材料,當其尺寸小于某一臨界值時,它們在常溫下就具備了超順磁性,即它們具有較大磁化率而矯頑力幾乎為零,宏觀上來看,超順磁性納米顆粒在磁場下表現出很強的磁性,撤掉磁場則迅速失去磁性,而不會發生團聚,從而使它們操縱起來特別方便,基于磁性納米顆粒的磁分選技術已經廣泛應用到生物、化學、醫學等領域[14-17]。

鑒于基于量子點和磁性納米顆粒的功能材料在生物化學研究中極高的應用價值和非常廣闊的應用前景,作為相關專業的大學生,非常有必要了解這方面的前沿知識?；诖?在大量教學和科學研究的基礎上,設計了“磁性熒光納米球的制備及其對細胞的識別和捕獲”綜合研究型實驗,該實驗通過將磁性納米顆粒和量子點包埋進高分子球內部制得磁性熒光納米球,進一步通過生物修飾在納米球表面引入能夠特異性識別腫瘤細胞的靶向分子,從而實現對腫瘤細胞的識別和捕獲。整個實驗涉及到化學制備、生物偶聯、識別捕獲等操作,熒光、磁性、形貌等表征技術,以及生物化學實驗中常見儀器的使用。既能夠全面培養學生的實驗操作技能,又能向學生展示納米材料在生物化學中最新進展,具有綜合性、新穎性、前瞻性而且操作容易,非常適合作為生物化學的綜合研究型實驗。

2 實驗原理

根據相似相容原理,油溶性的量子點和磁性納米顆粒表面為疏水配體、可以進入具有疏水空腔的高分子球內部,從而將納米顆粒包埋到納米球內部。此即為制備熒光磁性球的最重要的一種方法——溶脹包埋法(其他3種主要方法分別為聚合包埋法、組裝法和原位合成法)[9]。該法操作簡便,直接使用油相納米粒子且幾乎不破壞納米粒子表面的配體結構,因而最大限度地保持了納米粒子的光學和磁學性能。本實驗選用無乳聚合法合成的苯乙烯-丙烯酰胺共聚高分子球,其外部具有親水基團,內部為疏水碳鏈結構,在溶脹劑的作用下能夠產生疏水空腔,通過超聲油溶性的量子點和磁性納米顆粒就可以通過疏水相互作用進入疏水空腔中，然后將納米球從溶脹劑轉移至水相,納米球體積迅速縮小復原,從而將納米顆粒禁錮在納米球內部,制得磁性熒光納米球(MFNs)[18-19]。

進一步通過共價偶聯,在磁性熒光納米球表面修飾具有特異靶向性的生物分子,從而實現對目標物的識別。本實驗選用乳腺癌SK-Br-3細胞為目標物,靶向分子選用抗上皮細胞黏附分子(EpCAM)抗體,SK-Br-3細胞表面存在大量的EpCAM,因此兩者可以通過抗體抗原的作用實現結合。在實驗中,利用“Carbodiimide chemistry”[20]將納米球表面的羧基與抗體上的氨基偶聯,制得對SK-Br-3細胞靶向的磁性熒光納米球,將其投入到含有SK-Br-3細胞的樣品中,即可利用納米球表面抗體與腫瘤細胞表面抗原的親和作用完成對SK-Br-3細胞識別和捕獲。圖1為磁性熒光納米球的制備、生物修飾及其捕獲腫瘤細胞示意圖。

圖1 磁性熒光納米球的制備、生物修飾及其對腫瘤細胞的捕獲示意圖

3 實驗進度安排

如圖2所示，開放性實驗的教學過程分為3個階段,即實驗準備、實驗執行和實驗拓展。該實驗需要較好的實驗基礎,建議在已經掌握一定實驗技能的大三學生中開展。

圖2 實驗進度安排

4 實驗

4.1 試劑與儀器

試劑:羧基化的苯乙烯-丙烯酰胺共聚高分子球,油溶性紅色CdSe/ZnS 量子點,油溶性Fe3O4磁性納米顆粒,正丁醇,氯仿,乙醇,抗EpCAM抗體,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),pH 6.8、0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 6.8 PBS),pH 7.2、0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 7.2 PBS),磷酸鹽平衡生理鹽水(1×PBS),乳腺癌SK-Br-3細胞(濃度約為1×106個/mL,分散于1×PBS中)。

儀器:超聲波清洗器,離心機,磁力架,暗箱紫外分析儀,恒溫振蕩器,分析天平,熒光倒置顯微鏡,透射電鏡。

4.2 實驗內容

4.2.1 MFNs的制備

取1.5 mL高分子球懸液于2 mL離心管中,離心(16 000 r/min，30 min)得高分子球沉淀,晾置5 min;取溶于正己烷的磁性納米顆粒300 μL和量子點500 μL,加入3倍體積乙醇,離心(12 000 r/min，3 min)得到磁性納米顆粒和量子點的沉淀;用600 μL溶脹劑(氯仿和正丁醇的混合溶液,兩者體積比為5∶95)超聲分散上述納米顆粒沉淀;然后加入晾置的高分子球沉淀中,繼續超聲30 min;通過離心(12 000 r/min，5 min)得沉淀,用乙醇洗滌沉淀2次;最后向納米球沉淀中加入1 mL超純水,超聲1 h;靜置過夜取上清,即得MFNs。

4.2.2 MFNs的表征

形貌表征:分別取10 μL未包埋納米顆粒的高分子球的稀釋液以及制得的MFNs的稀釋液滴到碳支持膜上,放置過夜晾干。通過透射電鏡觀察并拍照。

磁性表征:將裝有MFNs懸液的離心管緊貼磁力架,每隔20 s拍照,觀察磁響應情況。

熒光表征:將裝有MFNs懸液的離心管置于暗箱紫外分析儀中,打開紫外燈,觀察MFNs的發光情況并拍照；取3 μL MFNs滴至載玻片上,蓋上蓋玻片,置于熒光倒置顯微鏡上,選取紫外激發光,用100×油鏡進行觀察并拍照。

4.2.3 MFNs的生物功能化

取200 μL MFNs,用pH 6.8 PBS通過磁分選洗滌2次,分散到400 μL、pH 6.8 PBS中,超聲均勻,加入分別用200 μL、pH 6.8 PBS溶解的EDC(8 mg)和NHS(4 mg)；混勻后置于恒溫振蕩器上150 r/min室溫下反應30 min;將產物用pH 7.2 PBS洗滌3次,分散到800 μL、pH 7.2 PBS中,加入40 μg抗EpCAM抗體,置于恒溫振蕩器上150 r/min室溫下反應4 h；將產物用pH 7.2 PBS洗滌5次,除去未反應的分子,分散于200 μL 1×PBS中,即得偶聯了抗EpCAM抗體的磁性熒光納米球(MFNs-anti-EpCAM),存于4°C冰箱待用。

4.2.4 MFNs-anti-EpCAM用于腫瘤細胞的識別和捕獲

分別進行以下2個實驗:(1)取100 μL SK-Br-3細胞懸液到入1.5 mL離心管中,補充1×PBS 900 μL,加入10 μL MFNs-anti-EpCAM；(2)取100 μL SK-Br-3細胞懸液到入1.5 mL離心管中,補充1×PBS 900 μL,加入10 μL未進行生物修飾的MFNs。將上述兩支離心管置于恒溫振蕩器上,37°C下輕搖孵育30 min,磁分選并洗滌,收集捕獲產物并用熒光顯微鏡觀察。

4.3 結果與討論

4.3.1 MFNs的性能研究

圖3為未包埋納米顆粒的高分子球和包埋了納米顆粒的MFNs透射電鏡圖。學生可以很清楚地觀察到:相比于原球,制得的MFNs內部存在襯度更大的小顆粒,MFNs的尺寸相比于原球幾乎沒有變化且表面相對平滑,從而非常直觀地證明納米顆粒進入了高分子球內部。學生通過將MFNs懸液用磁鐵吸引不同的時間觀察MFNs被吸引的情況表征了MFNs磁響應速度(見圖4),可以看出隨著吸引時間的延長,MFNs被逐漸吸引到靠近磁鐵一邊的管壁上,大約80 s后,幾乎所有的MFNs都能被磁鐵捕獲,說明MFNs具有較快的磁響應,通過磁鐵即可很方便地進行操縱。

裝有MFNs懸液的離心管置于暗箱紫外分析儀中觀察MFNs的發光情況如圖5(a)所示,可以看到明顯的紅色熒光信號。圖5(b)顯示了熒光顯微鏡下觀察到的單顆磁性熒光納米球的發光情況,可以看出MFNs的熒光很強,且具有良好的分散性。以上表征表明量子點和磁性納米顆粒被成功地包埋進高分子球內部,制得的MFNs具有快速的磁響應以及優良的熒光性能。

圖4 MFNs懸液在磁力架(磁鐵)吸引不同時間下的照片

圖5 MFNs懸液在紫外光照射下的照片和MFNs的熒光顯微鏡圖片

4.3.2 MFNs-anti-EpCAM對腫瘤細胞的識別和捕獲效果研究

將MFNs-anti-EpCAM、MFNs與SK-Br-3細胞作用后磁分選的產物用熒光顯微鏡觀察。圖6為MFNs-anti-EpCAM捕獲SK-Br-3細胞的明場和對應的熒光場圖片,可以看出存在大量的呈球形或橢球型的細胞,而且在紫外光激發下,細胞表面有很強的紅色熒光信號。圖7是MFNs捕獲SK-Br-3細胞的明場和對應的熒光場圖片,幾乎沒有觀察到細胞,只能觀察到呈單分散狀態的磁性熒光納米球。實驗結果表明MFNs-anti-EpCAM能夠識別和結合SK-Br-3細胞,進一步通過磁分選完成對細胞的捕獲,而未修飾抗體的MFNs幾乎不能夠識別和捕獲SK-Br-3細胞。學生分析為:EpCAM表達于SK-Br-3細胞表面,抗EpCAM抗體可以通過抗原抗體作用與SK-Br-3細胞結合。MFNs-anti-EpCAM連有抗體,故能夠和SK-Br-3細胞結合,從而很好地識別和捕獲SK-Br-3細胞,而未進行生物修飾的MFNs由于表面不存在可以和細胞結合的分子,所以不能識別和捕獲SK-Br-3細胞。

圖6 MFNs-anti-EpCAM分選SK-Br-3細胞捕獲產物的顯微鏡明場圖片和對應的熒光場圖片

圖7 MFNs分選SK-Br-3細胞捕獲產物的顯微鏡明場圖片和對應的熒光場圖片

5 結語

本實驗將磁性納米顆粒和量子點包埋進高分子球內部制得了具有快速磁響應以及優良熒光性能的磁性熒光納米球,通過生物修飾在納米球表面引入能夠和腫瘤細胞特異性結合的生物分子,從而成功實現了腫瘤細胞的識別和捕獲。該實驗將材料合成、表征、修飾、應用形成一套完整的科研訓練過程,培養了學生的實驗技能、科研素養和創新精神。該實驗涉及到量子點、磁性納米顆粒等熱門納米材料的性質和應用,有助于學生了解科研前沿進展以及科學研究的魅力,從而激發學生學習的積極性以及從事科學研究的興趣。該實驗可進行如下兩方面拓展：(1)設計實驗用MFNs識別和捕獲其他生物對象,如其他腫瘤細胞、細菌、蛋白質、DNA等；(2)從量子點的一元激發多元發射出發,設計同時識別和捕獲多種生物對象的方案。

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