工業(yè)微生物菌種的保藏方法

王 利

海正藥業(yè)（杭州）有限公司 浙江 杭州 311404

正文：

微生物資源是我國重要的戰(zhàn)略生物資源。微生物產(chǎn)業(yè)已成為繼動植物之后的第三大生物產(chǎn)業(yè)。歐美發(fā)達國家生產(chǎn)總值的8%-12%與微生物有關。微生物產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值不斷增長，在工業(yè)、農業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)境、能源等諸多領域發(fā)揮著重要作用。工業(yè)微生物菌株作為生物發(fā)酵生產(chǎn)的源頭，對發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質量有著重要的影響，是保證發(fā)酵產(chǎn)品質量穩(wěn)定的關鍵環(huán)節(jié)。保存方法的合理與否對保持菌株的優(yōu)良特性至關重要。

1 概述

1.1 微生物菌株的定義是一個基本的分類單元，是表型特征高度相似、關系密切、與同屬其他菌株差異明顯的一大類菌株的總稱。目前工業(yè)生產(chǎn)中最常見的微生物是細菌、放線菌和真菌。

1.2 微生物菌株在繁殖過程中會受到環(huán)境條件的影響而不斷變化，大部分變化與工業(yè)生產(chǎn)目標的預期不一致，為負變化。在工業(yè)生產(chǎn)中，由于重要性狀屬于數(shù)量性狀，因此具有負向變化的傾向。隨著代數(shù)的增加，當陰性細胞占有一定優(yōu)勢時，細菌就會發(fā)生降解。正確的保存方法是在保存過程中減少細菌的自發(fā)性傳播，從而減少細菌降解的機會

1.3 一般是通過菌株在缺氧、缺水、低溫、低營養(yǎng)條件下的貯藏來抑制菌株的新陳代謝，使其通過停滯甚至進入休眠狀態(tài)。在實踐中，低溫保存細菌的效果往往更好。例如-195(-液氮或低溫冰箱)的效果優(yōu)于-70(-干冰或低溫冰箱)，-70℃優(yōu)于-20℃，-20℃優(yōu)于4℃。

2 工業(yè)微生物菌種的保存方法

2.1 邊坡低溫保存方法。

細菌應該每月移植一次。傾斜應變應連續(xù)保存三代，以控制和防止事故和污染造成的損失。該方法的孵育時間和溫度影響其保鮮質量。培養(yǎng)時間短，保鮮過程中容易死亡，培養(yǎng)時間長，生產(chǎn)效率高。這種方法常用于實驗室儲存。其優(yōu)點是保存操作簡單，菌株使用方便，沒有特殊設備，能夠對保存菌株進行死亡、突變和污染檢測。適用于不需要長期保存或凍干保存的菌株。該方法的缺點是貯存時間短，菌株易發(fā)生突變，菌株在貯存過程中維護多樣，菌株容易被污染。

2.2 液體石蠟的保存。

礦物油保藏法，又稱礦物油保藏法，是常規(guī)移植保藏法的補充方法，由法國呂米埃于1914年創(chuàng)立。具體操作如下:(1)選用優(yōu)質化學純液體石蠟，將液體石蠟單獨包裝并塞好，用牛皮紙包好，用濕熱滅菌(滅菌后烘干)或干熱滅菌對石蠟進行滅菌，無菌檢查后保存。(2)斜培養(yǎng)獲得較強的真菌或孢子。(3)在無菌條件下，將石蠟注入細菌生長的斜坡。石蠟的用量應比坡頂高1厘米，以隔離空氣中的細菌。該方法實用有效。真菌、放線菌和孢子菌可保藏2-10年，酵母可保藏1-2年，非孢子菌可保藏1年左右，即使是一般方法難以保藏的腦膜炎球菌也可保藏3個月。此外，本方法不適用于石蠟為碳源的微生物保藏或對石蠟特別敏感的微生物保藏。

2.3 干燥保存方法。

微生物芽孢或芽孢在干燥環(huán)境中對死亡的抵抗力很強，干燥可以使其代謝活性降低到休眠狀態(tài)。干保存法是將菌株接種到合適的材料中，人為創(chuàng)造干燥環(huán)境，達到菌株保存的目的。干燥保鮮的載體可以是沙子、濾紙、硅膠、麥麩等。干燥保鮮的方法有冷凍干燥和真空干燥。以濾紙保藏方法為例，將細胞或孢子吸附在濕無菌濾紙上，干燥后低溫(如4c)保存，細菌和酵母可以保存2年左右，一些絲狀真菌甚至可以保存14-17年。該方法具有貯存時間長、維護簡單、無特殊設備等優(yōu)點。

2.4 超低溫保存方法

該方法通常將菌株保存在液氮或低溫-150～195c的冰箱中，甘油和二甲基亞砜通常用作菌株的保護劑。通常微生物的代謝幾乎完全停滯在-130攝氏度以下，因此低溫貯藏被認為是世界上最有效的防止細菌降解的方法。隨著制冷技術的發(fā)展，超低溫保鮮已有幾十年的歷史，廣泛應用于工業(yè)發(fā)酵菌種的保鮮。本方法適用于各種微生物菌株的保存，包括支原體、原生動物、藻類等。該方法將含有保護劑的細菌懸液密封在無菌冷凍管中，然后緩慢冷凍。理想的冷卻和速凍溫度為1C/min。當溫度逐漸下降到-35c時，微生物懸液迅速被放入液氮罐或深冷冰箱中。當細菌再次培養(yǎng)時，它們需要迅速融化，然后在適當?shù)臏囟认略谝后w培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2.5 上述方法可以根據(jù)菌株本身的特點、菌株保存的目的以及實驗室的具體條件和需要進行選擇。特定的保存方法(包括保護劑的選擇)應該通過實驗,來研究,最好是為每個應變采用以上兩種方法,并根據(jù)保存菌株的保質期,定期進行恢復測試和更新菌株進入。

3 對我國細菌保護的思考與建議

3.1 加強統(tǒng)籌規(guī)劃。我國文物保護中心的數(shù)量比較多，且規(guī)模比較大，管理內容比較復雜，所以，在實際管理的時候，很容易出現(xiàn)管理混亂問題，無法有效保障管理質量。為了保證微生物資源的管理效果，應建立起專門的微生物資源體系，并將其統(tǒng)一保存在儲存機構，各個保存機構應根據(jù)地區(qū)的環(huán)境特點以及自然條件來進行菌株保存。每個機構都有自己的職能，可以互補彼此的優(yōu)勢。例如，一個或幾個保存機構專注于真菌，而其他機構專注于病毒。

3.2 建立專項運營組織。我國必須要加強對細菌保管機構管理的重視，建立起專門的細菌菌株保管機構，確保菌株可以得到有效保管。同時，還需要對菌株訂購信息進行不斷的更新，運營機構應根據(jù)菌種的實際特點，來選擇合理、可行的運營模式，并采用各種運營手段，來增加用戶數(shù)量，使細菌市場得到有效擴展。

3.3 建設信息平臺。確保信息共享，并防止資源浪費問題的發(fā)生，促進國內外保護組織的交流與合作。中國應該建立一套通用的互聯(lián)網(wǎng)信息平臺，將國內大大小小的菌種庫連接起來，形成信息網(wǎng)絡，實現(xiàn)資源的交換。每個應變存儲單元都可以依賴于同一個大數(shù)據(jù)存儲系統(tǒng)，借助軟件的幫助，可以將所有應變信息錄入系統(tǒng)，并與網(wǎng)絡同步，供每個單元進行查閱和交換。