氨氮對異養硝化菌Acinetobactor sp.活性影響及動力學特性分析

王秀杰,王維奇,李 軍,王思宇,張 晶,魏 佳,趙白航

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氨氮對異養硝化菌sp.活性影響及動力學特性分析

王秀杰,王維奇,李 軍*,王思宇,張 晶,魏 佳,趙白航

(北京工業大學建筑工程學院,北京 100124)

異養硝化菌株sp.JQ1004能夠在初始氨氮濃度為0~2000mg/L范圍內進行生長和氮源代謝,菌株在初始氨氮濃度為2500mg/L條件下被完全抑制,無法生長.當菌株在溫度為30℃, pH7.5,轉速為160r/min,初始氨氮濃度分別為100,300,500, 700,1000,1500,2000,2500mg/L條件下培養時,菌株的最大比生長速率分別為0.251, 0.308, 0.286, 0.243, 0.197, 0.115, 0.088h-1,相應的最大比氨氮降解速率分別為1.335, 1.906, 1.859, 1.759, 1.562, 1.286, 0.965g/(gDCW·d).在高濃度氨氮和游離氨的抑制作用下,菌株的比生長速率及對氨氮的比降解速率隨初始氨氮濃度的增加呈先增加后降低的趨勢.3種基質抑制動力學模型(Haldane, Yano, Aiba模型)均能夠很好地模擬菌株隨初始氨氮濃度的生長變化規律,對應地相關系數分別為0.9944,0.9983和0.9929.由Haldane模型可知,菌株在不同初始氨氮濃度(游離氨)條件下的最大氨氮比降解速率max為2.604h-1,基質親和系數s為22.57mg/L,基質抑制系數i為1445.31mg/L.其中由i值遠大于自養菌(硝化細菌及厭氧氨氧化菌等)的值,這表明異養硝化菌株sp.JQ1004比自養菌具有更強的抗抑制能力.另外,菌株在游離氨濃度為5.436mg/L時,比生長速率達到最大值0.583h-1.以上研究結果表明,菌株JQ1004在處理高氨氮廢水中具有潛在的應用前景.

異養硝化；動力學；高氨氮；氨氮抑制

近年來,對高氨氮廢水的處理已成為污水處理的一個難點.高氨氮廢水若處理不當直接排入受納水體,會造成水體富營養化等問題,對環境造成嚴重危害.通常,將含氨氮濃度超過500mg-N/L的廢水稱為高氨氮廢水[1].高氨氮廢水主要來源于垃圾滲濾液[2]、養殖廢水[3]、焦化廢水[4]等.由于生物處理工藝具有能耗低、效率高等優點,已經被越來越多應用于高氨氮廢水的處理中.常用的工藝有短程硝化[5]、同步硝化反硝化(SND)[6]等以及它們的一些組合工藝.這些傳統生物處理工藝大多數依賴于自養型好氧/厭氧菌(硝化菌、厭氧氨氧化菌等),由于自養菌的世代周期長,且抗氨氮及有機碳等沖擊負荷能力差,導致了生物處理系統的不穩定性[7].

Verstraete等[8]在1972年從自然界中成功分離出第一株異養硝化菌sp.之后, Robertson和Kuenen[9]又從活性污泥中分離出了一株同時兼有異養硝化和好氧反硝化功能的菌株(現已更名).在這之后越來越多異養硝化好氧反硝化菌株被分離出來,如CF-S27[10],Y-11[11],YB[12]等.很多異養硝化好氧反硝化菌株具有能夠在高濃度氨氮條件下生長代謝的特點[13].研究者們利用這一特點將該類異養硝化好氧反硝化菌應用于高氨氮廢水的處理中.Joo等[14]將異養硝化菌株strain No. 4應用于實際的養豬廢水處理中,并取得了很好的去除效果.Chen等[15]建立一個處理高鹽高氨氮廢水的生物脫氮系統,并實現了穩定運行,利用PCR-DGGE技術檢測到系統中優勢菌株為異養硝化好氧反硝化菌和.菌株等[16]被以生物添加的方式應用于SBR工藝中處理高氨氮廢水并同樣取得了很好的效果.以上工藝的建立均表明,異養硝化好氧反硝化菌株在處理高氨氮廢水中具有很好的應用前景.本研究通過批式實驗研究了菌株在不同初始氨氮濃度條件下的生長及代謝規律,并確定了氨氮及游離氨濃度對菌株的抑制動力學模型,以期為菌株在處理高氨氮廢水中的應用提供基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗菌株和培養基

1.1.1 菌株來源 實驗菌株sp. JQ1004為一株異養硝化好氧反硝化菌[17],分離自北京市高碑店污水廠中試設備的活性污泥,已被證實能夠在好氧條件下,以琥珀酸鈉為碳源,分別以氨氮和硝氮為氮源進行生長代謝.當氨氮作為唯一氮源時,菌株能夠迅速利用氨氮和有機碳進行生長代謝, 當培養基中不添加有機碳源時,菌株JQ1004無法生長,這表明菌株具有異養硝化作用.另外,菌株JQ1004能夠在好氧條件下,以硝氮為氮源進行生長代謝,這表明菌株具有好氧反硝化作用.

1.1.2 培養基 實驗用培養基為異養硝化培養基[12],其配方為(NH4)2SO40.47g,(CH2COONa)2·6H2O4.219g, 50mL維氏鹽溶液, 950mL超純水,通過改變加入(NH4)2SO4的質量改變培養基初始氨氮濃度,固定TOC/TN=7.5.維氏鹽溶液配方為K2HPO4·3H2O 6.55g, MgSO4·7H2O 2.5g, NaCl 2.5g, MnSO4·H2O 0.038g, FeSO4·7H2O 0.05g, 1000mL超純水.培養基在使用前用Na2HPO4和NaH2PO4緩沖溶液調整pH=7.5,121℃高壓蒸汽滅菌15min.平板培養基需加入1.5%~2%瓊脂粉.

1.2 批次實驗

1.2.1 不同初始氨氮條件下菌株降解實驗 將新鮮平板培養基上生長茁壯的單菌落接種于液體異養硝化培養基中進行活化,然后8000r/min離心5min收集菌體,用磷酸緩沖溶液反復洗滌3次,重懸于無菌水中作為接種液,固定接種液OD600值約0.5.菌株在不同初始氨氮濃度條件下的降解實驗設置8個批次,初始氨氮濃度分別設定為:100,300,500,700,1000,1500,2000,2500mg/L.每個批次均設置不加接種液的空白組作為對照.培養條件為30℃,160r/min.定時取樣測定氨氮、硝氮、亞氮、COD濃度以及菌懸液OD600值,數據測定3次取平均值.

1.2.2 細胞濃度的測定[18]首先通過實驗確定菌株細胞濃度(細胞干重,mg/L)與菌懸液吸光度(OD600)之間的標準曲線.以液體培養基做空白,在600nm波長下測定菌懸液的吸光度,再根據標準曲線將OD600值換算為細胞干重(mg/L).細胞干重采用干燥法測定.

1.2.3 菌株比生長速率、氨氮比降解速率、產率系數以及游離氨濃度的計算[19-20]

式中:為菌株的比生長速率,h-1;為時刻時菌株的細胞濃度,mg/L;0為0時刻細胞濃度,mg/L;0為菌株培養任一階段的初始時刻,h;為菌株培養任一階段的結束時刻,h.

= -[(0-)/(0-)]/0(2)

式中:為比降解速率, g/(g DCW·d);0為初始時刻0氨氮濃度,mg/L;為時刻氨氮濃度, mg/L;0為0時刻菌株的細胞濃度,mg/L; DCW為細胞干重.

式中:為產率系數, mg DCW/mg N;0為初始時刻細胞濃度, mg/L;為結束時刻細胞濃度, mg/L;0為初始時刻氨氮濃度, mg/L;為結束時刻氨氮濃度, mg/L.

1.3 分析項目和方法

NH4+-N:納氏試劑分光光度法; NO2--N: N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N:麝香草酚分光光度法; CODcr:重鉻酸鉀法; OD600值:分光光度法; pH值、溫度: WTW/Multi3420便攜式測定儀.

2 結果與討論

2.1 不同初始氨氮濃度對菌株活性及基質降解速率的影響

(A)~(G)初始氨氮濃度分別為100,300,500,700,1000,1500,2000mg/L

表1 不同初始氨氮濃度下菌株的比生長速率及氨氮比降解速率

注:溫度為30℃, pH值約為7.5.

圖1展示了菌株在不同初始氨氮濃度條件下,菌株對碳源和氮素的降解以及菌株自身細胞濃度的變化情況.在不同初始氨氮濃度條件下菌株細胞濃度的增長規律均為先經過一定時間的遲滯期,且初始氨氮濃度越大遲滯期越長,之后進入對數生長期,在此時期菌株的比生長速率達到最大.表1顯示了不同初始氨氮濃度條件下,菌株的最大比生長速率、氨氮比降解速率以及在最大比生長速率發生時間段內菌株的產率系數值.由此可知,當初始氨氮濃度設置為100~2500mg/L時,菌株的比生長速率隨氨氮濃度的增加而降低,并且在濃度為2500mg/L時,菌株被完全抑制.相應地,菌株對氨氮的比降解速率規律也是隨初始氨氮濃度的增加呈降低趨勢.菌株在初始氨氮濃度為100mg/L時,比生長速率及比降解速率達到最大,分別為0.308h-1,2.021g/(g DCW·d).Zhang等[21]研究了菌株WSW-1001在初始氨氮濃度分別為5~1000mg/L時,菌株的代謝規律,得到了同樣的規律,菌株在初始氨氮濃度越低時,生長及降解速率越快.與已報道過的異養硝化好氧反硝化相比,菌株JQ1004的最大比生長速率大于菌株sp. S1(最大比生長速率為0.186h-1)[22],菌株No.4(最大比生長速率為0.2h-1)[23]等.

圖1還展示了菌株在不同初始氨氮濃度下,菌株對氨氮的降解特性.由表1可知,當初始氨氮濃度設置為100~2500mg/L時,菌株對氨氮的比降解速率隨初始氨氮濃度增加而降低,這與比生長速率的變化趨勢一致.由表1可知,當初始氨氮濃度為100,300,500,700,1000,1500,2000mg/L時,菌株對氨氮的比降解速率分別為2.021,1.960, 1.859,1.759,1.562,1.286,0.965[g/g DCW·d]].另外,實驗表明菌株可在0~2000mg NH4+-N/L條件下生長,在氨氮濃度為2500mg/L時,菌株的生長被完全抑制.許多研究已表明,異養硝化好氧反硝化菌能夠在高負荷氨氮濃度下進行生長繁殖.例如,Joo等[14]研究表明,菌株可在1200mg N/L的條件下生長;Ren等[24]研究發現,菌株YB在1000mg N/L條件下仍然可以有較高地生長速率;菌株sp. Y1-5[25]等被證實了可以在初始氨氮為1600mg N/L條件下生長.同時,由圖1可知,菌株在進行代謝的過程中需要較多的碳源,即培養基中有較高COD濃度.由圖1可知,COD濃度的變化與氨氮濃度的變化一致,即先經過一定的緩慢遲滯期,菌株進入對數生長期后,COD濃度迅速被降解,最后進入穩定期后氮素和碳源降解速率緩慢降低,直到菌株停止生長.在菌株生長過程中,均未檢測到亞氮和硝氮的濃度變化.分析原因可能為以氨氮為氮源時,亞氮和硝氮作為中間產物在代謝過程中被迅速轉化并未產生積累;另一原因可能為菌株將氨氮直接轉化為氣態氮,并未轉化為硝氮或亞氮等中間產物.

2.2 不同初始氨氮濃度條件下菌株的降解動力學特性分析

表2 各種動力學模型參數的估計值

注:max為不同初始氨氮濃度條件下菌株的最大比生長率;s為基質親和常數;i為基質抑制常數;為Yano模型中的常數.

高負荷氨氮濃度會對菌株本身產生毒害作用從而抑制其對氨氮地降解.為探究最佳擬合模型,用3種不同的基質抑制動力學模型(Haldane模型, Aiba模型, Yano模型)來描述菌株對氨氮的比降解速率隨初始氨氮濃度(0~ 2000mg N/L)的變化,擬合后得到的動力學參數及相關系數(R)如表2所示.由圖2可知,3種模型均能很好地模擬實驗數據,相關系數(2)分別為0.9944,0.9983和0.9929. 3種模型的變化趨勢均為菌株對氨氮的比降解速率隨氨氮濃度的上升呈先上升后下降的趨勢,由Haldane模型可知,菌株JQ1004對氨氮的最大比降解速率為2.604g/(gDCW·d),發生最大比降解速率時的底物濃度可通過公式計算:

在Haldane模型中,Ks為基質親和常數,Ks值越小,則酶與底物的親和力越大,本實驗中Ks值為22.57mg/L,這表明菌株中含有的氨氧化酶與氨氮有較高的親和力;另外,Ki為基質抑制常數, Ki值越小表明基質對菌株的抑制作用越強,反之,越大表示菌株的抗抑制能力越強[26].本研究中,異養硝化菌株Acinetobactor sp.JQ1004的Ki為1445.31mg/L,其值遠大于自養硝化菌[27][Ki為(59±5)mg/L],厭氧氨氧化菌[28](Ki為67.234mg/L),這表明菌株JQ1004具有更強的抗抑制能力,原因可能是菌株為異養好氧菌,與自養菌相比有更短的世代周期,且對環境的耐受性更強.

2.3 不同濃度游離氨對菌株活性的抑制作用

由Haldane模型擬合結果可知,菌株在不同初始氨氮濃度條件下對氨氮的降解呈先增加后降低的趨勢.原因是在一定濃度范圍內,底物濃度的增加促進了菌株的生長代謝,當底物濃度過高時會對菌株活性產生抑制.而高濃度氨氮對菌株產生抑制的原因是氨氮在環境中形成較高濃度的游離氨,過高的游離氨濃度會對菌株活性及生長產生抑制.為分析游離氨對菌株生長的抑制規律,采用Haldane模型模擬菌株在不同濃度游離氨條件下菌株的比生長速率變化情況.由圖3可知,在不同初始游離氨濃度條件下,菌株的比生長速率隨初始游離氨濃度的增加呈先增加而后降低的趨勢.這是由于氨氮在微堿性環境中形成了一定濃度的游離氨,較低濃度的游離氨有利于氨單加氧化酶的氧化[29],而過高濃度的游離氨會對菌株產生一定的抑制作用[20].基質抑制動力學模型Haldane模型很好地模擬了其生長規律,相關系數2為0.956.由公式計算可知,菌株在游離氨濃度為

時,菌株達到最大比生長速率為0.583h-1.當游離氨濃度超過該濃度時會對菌株產生抑制作用.

3 結論

3.1 菌株JQ1004能夠在高氨氮負荷(100~ 2000mg NH4+-N/L)條件下進行生長繁殖,并對氨氮具有一定的降解作用,在初始氨氮濃度為2500mg/L時,菌株生長被完全抑制.并且,菌株的生長與對氨氮的代謝速率隨初始氨氮濃度增加而降低.

3.2 Haldane模型、Aiba模型以及Yano模型能夠很好地擬合菌株在不同初始氨氮濃度條件下的降解動力學特性,相關系數(2)均在0.99以上.由Haldane模型可知,菌株在初始氨氮濃度為180.61mg/L時,氨氮比降解速率最大值2.604g/ (gDCW·d).由i值可知,與自養菌相比,異養硝化菌JQ1004對氨氮具有更強抗抑制能力.

3.3 Haldane模型同樣能夠較好的擬合初始游離氨(FA)濃度對菌株比生長速率的影響,相關系數2為0.956.菌株的生長隨FA濃度的增加而減慢,在FA濃度為5.436mg/L時,比生長速率達到最大值0.583h-1.

[1] 孫錦宜.含氮廢水處理技術與應用[M]. 北京:化學工業出版社, 2003.

[2] Liu J, Luo J, Zhou J, et al. Inhibitory effect of high-strength ammonia nitrogen on bio-treatment of landfill leachate using EGSB reactor under mesophilic and atmospheric conditions [J]. Bioresource Technology, 2012,113:239-243.

[3] Wang S, Wang L, Deng L, et al. Performance of autotrophic nitrogen removal from digested piggery wastewater [J]. Bioresource Technology, 2017,241:465-472.

[4] Ahmad M, Liu S, Mahmood N, et al. Synergic adsorption– biodegradation by an advanced carrier for enhanced removal of high-strength nitrogen and refractory organics [J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2017,9(15):13188-13200.

[5] Ren Y, Yan L, Hao G, et al. Shortcut nitrification treatment of high strength ammonia nitrogen wastewater by aerobic granular sludge [J]. Journal of the Chemical Society of Pakistan, 2016,38(6):1222-1222.

[6] Sun X, Zhang H, Cheng Z. Use of bioreactor landfill for nitrogen removal to enhance methane production through ex situ simultaneous nitrification-denitrification and in situ denitrification [J]. Waste Management, 2017,66:97-102.

[7] Tang C J, Zheng P, Wang C H, et al. Performance of high-loaded ANAMMOX UASB reactors containing granular sludge [J]. Water Research, 2011,45(1):135-144.

[8] Verstraete W, Alexander M. Heterotrophic nitrification bysp [J]. Journal of Bacteriology, 1972,110(3):955-961.

[9] Robertson L A, Kuenen J G.gen. nov. sp. nov., a facultatively anaerobic, facultatively autotrophic sulphur bacterium [J]. Microbiology, 1983,129(9):2847-2855.

[10] Padhi S K, Tripathy S, Mohanty S, et al. Aerobic and heterotrophic nitrogen removal byCF-S27 with efficient utilization of hydroxylamine [J]. Bioresource Technology, 2017,232:285-296.

[11] He T, Li Z, Sun Q, et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification byY-11without nitrite accumulation during nitrogen conversion [J]. Bioresource Technology, 2016,200:493-499.

[12] Yang L, Ren Y X, Liang X, et al. Nitrogen removal characteristics of a heterotrophic nitrifierYB and its potential application for the treatment of high-strength nitrogenous wastewater [J]. Bioresource Technology, 2015,193:227-233.

[13] Taylor S M, Yiliang H, Bin Z, et al. Heterotrophic ammonium removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying- denitrifying bacterium,YL [J]. Journal of Environmental Sciences, 2009,21(10):1336-1341.

[14] Joo H S, Hirai M, Shoda M. Piggery wastewater treatment usingstrain No. 4with heterotrophic nitrification and aerobic denitrification [J]. Water Research, 2006,40(16):3029-36.

[15] Chen J, Han Y, Wang Y, et al. Start-up and microbial communities of a simultaneous nitrogen removal system for high salinity and high nitrogen organic wastewater via heterotrophic nitrification [J]. Bioresource Technology, 2016,216:196-202.

[16] Phatak P S, Trivedi S, Garg A, et al. Start-up of sequencing batch reactor withfor treatment of high- strength nitrogenous wastewater and sludge characterization [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016,23(20):20065-20080.

[17] 王秀杰,王維奇,李 軍,等.異養硝化菌sp.的分離鑒定及其脫氮特性研究[J] 中國環境科學, 2017,37(11):4241-4250.

[18] Yan J, Wen J, Li H, et al. The biodegradation of phenol at high initial concentration by the yeast[J]. Biochemical Engineering Journal, 2005,24(3):243-247.

[19] Medhi K, Singhal A, Chauhan D K, et al. Investigating the nitrification and denitrification kinetics under aerobic and anaerobic conditions byISTOD1 [J]. Bioresource Technology, 2017,242:334-343.

[20] Anthonisen A C, Loehr R C, Prakasam T B, et al. Inhibition of nitrification by ammonia and nitrous acid [J]. Journal - Water Pollution Control Federation, 1976,48(5):835.

[21] Zhang S, Sha C, Jiang W, et al. Ammonium removal at low temperature by a newly isolated heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacteriumwsw- 1001 [J]. Environmental Technology, 2015,36(19):2488-2494.

[22] Sun Z, Lv Y, Liu Y, et al. Removal of nitrogen by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification of a novel metal resistant bacteriumsp. S1 [J]. Bioresource Technology, 2016,220:142-150.

[23] Joo H S, Hirai M, Shoda M. Characteristics of ammonium removal by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification byNo.4 [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005,100(2):184-191.

[24] Ren Y X, Yang L, Liang X. The characteristics of a novel heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacterium,YB [J]. Bioresource Technology, 2014,171:1-9.

[25] Li Y, Wang Y, Fu L, et al. Aerobic-heterotrophic nitrogen removal through nitrate reduction and ammonium assimilation by marine bacteriumsp. Y1-5 [J]. Bioresource Technology, 2017,230:103-111.

[26] Deng X, Wei C, Ren Y, et al. Isolation and identification ofsp. DN-06and evaluation of its pyridine degradation kinetics [J]. Water, Air, & Soil Pollution, 2011, 221(1-4):365.

[27] Ouyang Y, Norton J M, Stark J M. Ammonium availability and temperature control contributions of ammonia oxidizing bacteria and archaea to nitrification in an agricultural soil [J]. Soil Biology and Biochemistry, 2017,113:161-172.

[28] 李 蕓,熊向陽,李 軍,等.膜生物反應器處理晚期垃圾滲濾液亞硝化性能及其抑制動力學分析[J]. 中國環境科學, 2016, 36(2):419-427.

[29] Mével G, Prieur D. Heterotrophic nitrification by aspecies as influenced by different culture conditions [J]. Canadian Journal of Microbiology, 2000,46(5):465-473.

Inhibition of initial ammonia and free ammonia nitrogen onsp. and their biokinetics.

WANG Xiu-jie, WANG Wei-qi, LI Jun*, WANG Si-yu, ZHANG Jing, WEI Jia, ZHAO Bai-hang

(The College of Architecture and Civil Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)., 2018,38(3)：943~949

The strain JQ1004 with capability of heterotrophic nitrification were able to grow and metabolism under different initial ammonium concentrations in range of 0~2000mg/L. However, the strain were completely inhibited in concentration of 2500mg/L. When strain JQ1004 was cultivated at 30℃, pH 7.5, 160rpm with the initial ammonium of 100, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000mg/L, the maximum specific growth rates were 0.251, 0.308, 0.286, 0.243, 0.197, 0.115, 0.088h-1, and the corresponding ammonium specific removal rates reached 1.335, 1.906, 1.859, 1.759, 1.562, 1.286, 0.965g/g (DCW·d), respectively. Due to the inhibition of free ammonia and high-strength concentration of ammonium, the specific growth rate and degradation rate of ammonia increased at first and decreased with the increase of initial concentration of ammonia nitrogen (free ammonia). Three kinetic models (Haldane, Yano, Aiba) were fitted well to the experimental growth kinetic data with the correlation coefficients (2) of 0.9944,0.9983 and 0.9929. For Haldane model, the values ofmax,s, andiwere 2.604h-1, 22.57mg/L, and 1445.31mg/L, respectively. The large values ofi, far greater than that of autotrophic nitrifiers or anaerobic ammonium-oxidizing bacteria, indicated that JQ1004 had good tolerance against high ammonium concentrations. Besides, the specific growth rate reached a maximum value of 0.583h-1when the concentration of free ammonia was 5.436mg/L.These results indicated possible future applications of JQ1004 in removing nitrogen and organic carbon from high-strength ammonium wastewater.

heterotrophic nitrification；biokinetics；high-strength ammonium；ammonia inhibition

X703.5

A

1000-6923(2018)03-0943-07

王秀杰(1991-),女,山東濰坊人,博士研究生,主要從事生物脫氮及環境分子生物學研究.發表論文2篇.

2017-08-06

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2014ZX07201-011);16人才培養質量建設-雙培養計劃新興專業建設(004000542216031)

* 責任作者, 教授, 18810925108@163.com