西南地區榧樹屬植物3種不同總DNA提取方法的比較分析

劉風路　張金麗　李靖　馬長樂

摘 要：以西南地區榧樹屬植物葉片為材料，利用改良CTAB法，改良SDS法和試劑盒法提取其總DNA，采用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳方法檢測所得總DNA的得率和純度，用PCR擴增的方法檢測所得總DNA的質量，并對3種不同提取方法的結果進行比較分析。結果表明，3種不同提取方法提取到的總DNA都能滿足后期分子標記的要求，其中，改良CTAB法得率最高但純度稍差，改良SDS法次之，試劑盒法得率最低但純度高。為了更好的進行后期的分子試驗，選擇試劑盒法提取純度較高的DNA。

關鍵詞：DNA提取；榧樹屬；PCR擴增

中圖分類號：S718.43 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.001

Abstract：In present study， three different methods of total DNA extraction， including SDS， CTAB and DNA extraction Kit （DNeasy Plant Mini Kit） were used to isolate genomic DNA from leaf materials of Torreya. The total genomic DNA yielded by the three methods were quantified and analyzed by spectrophotometer， agarose gel electrophoresis and PCR reaction， respectively. The results showed that the total DNA extracted by three different extraction methods could meet the requirements of the later molecular markers. And the modified CTAB method had the highest yield but the lesser purity， followed by the modified SDS method； the kit method had the lowest yield of but the high purity. In order to better carry out later molecular experiments， the kit method was selected to extract DNA with higher purity.

Key words： DNA extraction methods； Torreya； PCR amplification

榧樹屬（Torreya Arn.）屬于裸子植物門紅豆杉科（Taxaceae），我國共有5種2變種，均被列為國家Ⅱ級重點保護野生植物[1-3]，其中，西南地區野生榧屬植物有2種1變種：巴山榧（T. fargesii），四川榧[4]（T. parvifolia）和云南榧（T. yunnanensis）。榧樹是集藥用、果用、油用、材用、觀賞和環保等多種用途于一體的珍貴經濟樹種[5-8]。

受抗癌藥物研究熱度增高的影響，近年來對榧樹屬植物藥用功能和遺傳保護方面的關注日益增多。高質量的總DNA是進行分子生物學實驗的基礎，也是實驗是否能夠成功的關鍵因素之一，而提取到的總DNA純度是制約PCR反應的因素之一[9-10]，因此，能夠提取到質量和純度均較高的總DNA十分重要。胡文翠等[11]用CTAB法分別對香榧胚乳、新老葉片以及1年生幼果進行DNA提取發現，以香榧嫩葉為試驗材料提取DNA的效果最好。胡芳名等[12]用改良CTAB法，提取到香榧種子胚乳中的總DNA，但此方法操作較為繁瑣，獲得的初級提取物雜質較多。葉冰瑩等[13]用低pH值介質，高鹽沉淀蛋白質方法提取闊葉榧新鮮葉片總DNA，所得總DNA質量和純度均較高，可直接用于限制性內切酶酶切，并可用于隨機引物PCR擴增。

由于裸子植物組織通常含有較高的次生代謝物質，這些次生物質與核酸形成復合物，提取出的總DNA質量和純度通常很難達到分子生物學實驗的需求[13]，而且不同植物體內化學成分存在一定差異，導致即使近緣類群提取總DNA的方法也略有不同，因此，需要針對不同樣品的特點建立有效的提取方法。

本試驗使用改良CTAB法、改良SDS法和試劑盒法對西南地區榧屬植物的總DNA進行比較分析，以找到其最佳的提取方法，旨在為開展后續的分子生物學試驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試巴山榧和四川榧嫩葉采自野外（硅膠干燥并在-20 ℃下保存），云南榧嫩葉采自學校大棚扦插栽培的植株（試驗前1 h采集，置于冰盒中備用），樣品編號及采集地如表1所示。

1.2 儀器與試劑

主要儀器為制冰機、冷凍高速離心機、PCR儀、電泳槽、電泳儀、冰箱、烘箱、凝膠成像儀、分光光度計等。提取液為SDS提取緩沖液[14]和CTAB-free緩沖液[15]。

1.3 方 法

1.3.1 總DNA提取方法 參照劉杰等[14] SDS法和CTAB法操作步驟并稍加改變提取總DNA，區別在于：精確稱量0.03 g葉片；氯仿-異戊醇（體積比24∶1）抽提3次；試劑盒法使用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（BioTeke），操作步驟按試驗說明書進行。

1.3.2 DNA檢測方法 使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法檢測總DNA的得率、純度和質量，并對核糖體ITS片段和葉綠體的psbA-trnH片段進行PCR擴增，進一步檢測所得總DNA的質量。

（1）總DNA得率和純度檢測。各取1 μL總DNA溶液置于Nandrop2000超微量紫外分光光度計中，可得到總DNA濃度和A260/A280值，以總DNA濃度計算其得率，根據A260/A280值判斷總DNA的純度。

（2）總DNA質量檢測。在1%的瓊脂糖凝膠中，于150 V電壓下電泳，后在凝膠成像儀下檢測總DNA的分子質量。

（3）PCR擴增檢測。以ITS和psbA-trnH為目的片段進行PCR擴增，ITS引物使用特異性引物ITSF[16]（5-3）：GCGGTAGGATCATTGTCG，和通用引物ITS4（5-3）：TCCTCCGC TTATTGAT ATGC，psbA-trnH[17]片段使用引物psbA （5-3）：GTTATGCATGAACGTAATGCTC， trnH（5-3）： CGCGCATGGTGGATTCACAATCC。2個目的片段的擴增體系相同：反應體系30 μL，包括50 ng·mL-1 DNA模板1 μL，正反引物各1 μL，PCR Master Mix（昆明碩擎）15 μL，其余用水補齊。ITS反應程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環，72 ℃延伸5 min； trnH-psbA反應程序與ITS基本一致，不同之處在于退火溫度為58 ℃，35個循環內延伸時間為1 min。2個反應程序中的退火溫度均由梯度試驗獲得。

2 結果與分析

2.1 總DNA的純度檢測結果

使用紫外分光光度計檢測提取到總DNA的純度，高純度DNA的A260/A280值應該在1.8～2.0 [18]。當A260/A280<1.8時，DNA樣品中可能存在蛋白質或者酚類物質的污染，當A260/A280>2.0時，DNA樣品總可能含有較多的RNA。從表2可以看出，本試驗所用3種提取植物總DNA的方法中，試劑盒法、改良CTAB法和改良SDS法所得總DNA的A260/A280值范圍分別在1.90～1.97、1.87～2.01和1.88～2.03，3種提取方法總DNA的A260/A280值均大于1.8，說明蛋白質和酚類物質去除較為徹底，僅改良CTAB法和改良SDS法提取的新鮮樣品YN的A260/A280值略大于2.0，可能是由于RNA的去除效果不好，影響了光吸收值導致的。在總DNA得率方面，改良CTAB法得率最高，其范圍在20.25～27.70 μg；其次是改良SDS法，得率范圍在17.75～22.56 μg；試劑盒法得率最低，其范圍在12.78～14.91 μg。3種提取方法不同樣品均以試驗前1 h采集的樣品YN得率最高，說明相同保存條件下，時間越久，樣品的得率就越低。

2.2 總DNA電泳檢測結果

從圖1可以看出，3種不同提取方法的總DNA基本上都有一條明亮的高分子量條帶，說明3種不同DNA提取方法都能夠提取到完整的DNA。其中，新鮮樣品YN條帶明亮，無明顯拖尾現象，說明總DNA基本沒有降解；而硅膠保存的干樣WY和NC均出現拖尾現象，說明總DNA出現了部分降解。

2.3 PCR擴增檢測結果

DNA模板的質量對PCR擴增影響很大，故PCR擴增結果成為判斷DNA質量的重要依據之一。將3種方法提取的總DNA濃度稀釋到50 ng·μL-1用于PCR擴增，核糖體ITS和葉綠體psbA-trnH片段的擴增結果分別見圖2和圖3，所有的樣品均擴增成功，每個樣品只有一條明亮的帶，各樣品同一片段條帶亮度無明顯差別，擴增出的ITS和trnH-psbA片段大小分別在1 100 bp和800 bp左右。結果表明，3種不同方法提取的總DNA質量良好，均可用來進行后續試驗。

3 結論與討論

從提取得率來看，改良CTAB法>改良SDS法>試劑盒法；從總DNA電泳結果來看，新鮮樣品YN的完整性更高，干樣WY和NC都出現了不同程度的降解；從總DNA純度方面來看，試劑盒法提取的總DNA純度較高，改良CTAB法和改良SDS法提取的新鮮樣品YN總DNA的A260/A280值略高于2.0，但從結合核糖體ITS和葉綠體psbA-trnH片段的擴增結果來看，沒有影響到擴增的結果，滿足一般分子生物學試驗的需求。本試驗研究結果表明，3種方法提取的DNA均可用于后期的分子標記，但考慮DNA提取的效率和后期擴增的效果，對于榧樹屬植物葉片，最后選擇采取試劑盒法提取DNA。且近年來試劑盒法發展迅速，具有操作簡單，毒害少，效率高，提取質量高等優點，隨著試劑盒得率的增加，通用性的提升和價格的降低，將來會越來越受到大家的認可和青睞。

試驗材料的保存時間和保存方式會直接影響到植物總DNA提取的質量，最好選用新鮮的植物葉片作為試驗材料，但是西南地區野生的榧屬植物大多生長在人類活動范圍之外，且海拔較高，交通不便，故只能先將樣品硅膠干燥保存；同時，采集到的樣品保存時間越久總DNA降解越嚴重，為提高總DNA得率以確保后續試驗的開展，應該盡快提取總DNA，將樣品以DNA的狀態保存于-80 ℃冰箱；植物總DNA的純度與試驗材料的保存時間關系不大，而與提取的方法有關；另外，在試驗操作中要注意盡量減少機械性損傷葉片、研磨過程中樣品要一直浸泡在液氮中等[11]。

本試驗3種方法提取的總DNA可以滿足一般的分子試驗要求，但如果進行Southern Blot等深入的分子生物學試驗，需根據不同植物特點進行探索，優化提取條件，盡可能去除樣品中的蛋白質或酚類等雜質，以得到純度更佳的總DNA。

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