滇龍膽GrDXR基因特異性片段的克隆

桂子昌　李猛　張曉東

摘 要：GrDXR基因功能分析是揭示滇龍膽中MEP途徑的基礎，試驗提取滇龍膽總RNA，通過RT-PCR技術進行進行擴增，所獲得片段連接T載體后，進行測序，并進行序列分析。結果獲得了279 bp的基因片段，將測序結果與原基因序列進行比對，確認序列為GrDXR基因特異片段，為闡明其基因功能奠定基礎。

關鍵詞：滇龍膽；GrDXR基因；特異性片段；基因克隆

中圖分類號： Q785 文獻標識碼： A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.002

Abstract： The functional analysis of GrDXR gene is the basis of revealing the MEP pathway in Gentiana rigescens. Total RNA was extracted from Gentiana rigescensby experiment， and the fragment was obtained by RT-PCR technology， then it was sequenced and analyzed after ligating into T vector. Results showed that 279 bp gene specific fragment was obtained， and was verified by alignment with the original gene， which would pave ways for the functional elucidation of this gene.

Key words： Gentiana rigescens；GrDXR gene； specific fragment； gene cloning

滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.）為多年生草本植物，主要分布于云南、四川等地，其根部用來治療肝炎和膽囊炎[1-2]。目前，由于滇龍膽市場需求量逐年增加，野生滇龍膽遭到人為大肆破壞[3]。從合成生物學角度來看，滇龍膽主要藥效成分為龍膽苦苷，要大量合成龍膽苦苷，首先必須先弄清龍膽苦苷的生物合成途徑及其調控機理[4]。1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構酶（GrDXR）能夠催化1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP）生成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP），是龍膽苦苷生物合成中MEP途徑的重要限速酶[5]，對GrDXR進行基因功能分析是揭示滇龍膽中MEP途徑的基礎。RNAi是指利用一段特異的雙鏈RNA或單鏈反義RNA通過注射、轉染或轉基因的方法導入到細胞或模式生物體內，啟動一套信號通路來最終降解與這段RNA對應的mRNA，使該mRNA無法翻譯成蛋白質，從而在mRNA層面阻斷對應基因的功能[6]。研究表明RNAi技術是驗證基因功能的重要手段[7]，RNAi干擾的特異性和干擾效率取決于所選序列的特異性[7]。本研究采用比對分析的方法，獲得GrDXR基因序列的特異性片段，通過PCR技術對該片段進行擴增，然后進行TA克隆，最后通過測序手段確認已獲得GrDXR基因的特異性片段，旨在為GrDXR基因功能的解析奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 植物材料為滇龍膽（G. rigescens Franch.ex Hemsl）無菌苗，來自玉溪師范學院分子生物學實驗室。

1.1.2 生化試劑及試劑盒 氯仿、異丙醇、無水乙醇、ddH2O、Amp、TAE、2M醋酸鈉、MAX DNA Polymerase、質粒抽提溶液SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ、Tris-HCl、RNaseA、TE緩沖液、50%滅菌甘油、DNA Marker、LB液體培養基、瓊脂等。

1.1.3 質粒和載體 克隆載體pMD19-T Vector 購自Takara公司用于TA克隆，大腸桿菌（Escherichia coli）感受態細胞DH 5α購自全氏金公司。

1.1.4 主要儀器設備 全套移液器、離心管、電熱恒溫水槽、高速離心機、掌上離心機、凝膠成像系統、冷藏柜、制冰機、超純水系統、高壓滅菌鍋、電熱恒溫干燥箱、微波爐、電泳槽、梳齒、配套的制膠槽、電子天平、金屬浴、研缽、刀片、PCR儀、搖床培養箱、超凈臺等。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取、逆轉錄和PCR擴增 RNA提取、逆轉錄過程參照張曉東等[5]文獻，按照MAX DNA Polymerase使用說明，取出PCR所需試劑，置于冰上，PCR反應體系如下：cDNA 模板2 μL，MAX DNA Polymerase12.5 μL，基因特異引物F（10 μM）1 μL，基因特異引物R（10 μM）1 μL，ddH2O8.5 μL。總共25 μL。向PCR管內分別加入引物信息：

RNAiDXR-F：GGATCCACATTGCCCTGGCTAACAAGG；

RNAiDXR-R：CTCGAGAATCGACGGTAATCT-

TCTTCCC。

PCR反應條件：（98 ℃ 10 s → 59 ℃ 15 s → 72 ℃ 5 s ）× 35

PCR加尾：

Taq 1 μL

10×Buffer 3 μL

dATP 1 μL

PCR產物 25 μL 72 ℃ 30 min

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳 （1）瓊脂糖凝膠的制備。稱0.3 g瓊脂糖粉于錐形瓶，加入DNA電泳緩沖液1×TAE 30 mL，微波爐加熱溶解。待凝膠液稍冷卻至60 ℃后加入EB 2 μL，搖勻，倒膠。

（2）上樣。將DNA或RNA樣品與1/6總體積的6×Loding buffer混合，再加入1×TAE使體系總體積至20 μL。

（3）電泳。電壓5～8 V·cm-1，根據指示劑位置判定停止電泳后，在凝膠成像系統進行結果觀測。

1.2.3 目的DNA片段回收 （1）在紫外燈下將含有目的片段瓊脂糖凝膠用刀片切下來，此時注意盡量切除不含目的片段的凝膠，以提高DNA回收率。將其切碎，置于帶孔和石英棉的0.5 mLEP管中。

（2）將0.5 mL EP管置于1.5 mLEP中，室溫12 000 rpm離心15 min。

（3）取出0.5 mL EP管，將上清轉到新的EP管中。

（4）若有凝膠殘留，可液氮冷凍后，室溫12 000 rpm離心15 min。

（5）將收集到的溶膠液中，加入1/10體積的3M NaAc和等體積的異丙醇混合均勻，置于-20 ℃沉淀30 min。

（6）4 ℃，12 000 rpm離心20 min。

（7）棄上清，使用75%乙醇清洗2次。

（8）用槍吸去可見的殘留酒精，室溫自然干燥3～5 min，用適量的1×TE（pH值8.0）或ddH2O溶解，-20 ℃保存備用。

1.2.4 目的片段TA克隆 采用pMD19-T vector kit （Takara），反應體系如下：目的片段DNA（0.1～0.2 pmol）2.5 μL，T-載體（50 μg·mL-1）0.5 μL，Ligation Solution L3 μL，ddH2O2.5 μL。金屬浴16℃過夜連接12 h。

1.2.5 質粒DNA熱激轉化 （1）將50 μL大腸桿菌感受態細胞DH5α加入質粒6 μL體系中。

（2）冰浴20 min，42 ℃熱刺激45 s，冰浴2 min。

（3）加入890 μL SOC，37 ℃搖床200 rpm 45～60 min。

（4）培養結束后，10 000 rpm離心1 min。

（5）在超凈臺上吸去上清，剩余約0.1 mL時，用槍混勻，接入帶有Amp抗性的LB平板上，用無菌三角玻璃棒涂布均勻。

（6）37 ℃過夜培養。

1.2.6 質粒抽提 （1）取2.0 mL培養物于EP管中，室溫12 000 rpm離心1 min。

（2）棄上清，將EP管倒扣到衛生紙上除盡上清，加入SolutionⅠ200 μL，劇烈振蕩懸浮菌體后，加入SolutionⅡ400 μL顛倒離心管5～6次。

（3）加入Solution Ⅲ 300 μL，振蕩，再加入25 μL氯仿：異戊醇（24：1）混勻，室溫13 000 rpm離心10 min。

（4）轉移上清于一個潔凈離心管中，加異丙醇550 μL（等體積）混勻，-20 ℃靜置10 min，然后13 000 rpm，4 ℃離心15 min。

（5）棄上清，用75%乙醇1 mL清洗沉淀，然后12 000 rpm，4 ℃離心5 min。

（6）真空干燥沉淀2 min后，加20 μL含有RNaseA（20 μg·mL-1）的1×TE溶解。

（7）取2 μL在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測結果，其余-20 ℃保存。

1.2.7 質粒PCR檢測 以挑取菌落的菌液為模板，使用Taq酶、△DXR片段引物、dNTP、Buffer等，進行PCR檢測，PCR產物使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.8 測序檢測 對PCR檢測正確的克隆，取2 μL菌液，接種于3 mL LB+Amp液體培養基中，37 ℃ 200 rpm·min-1搖菌12 h后，取1 mL寄送上海進行DNA測序。

2 結果與分析

2.1 特異片段擴增

以滇龍膽葉片cDNA為模板，使用GrDXR基因特異片段△DXR引物擴增，結果擴增到300 bp大小的片段（圖1）。

2.2 連接、轉化與重組質粒的篩選

目的片段膠回收后，連接至19T載體，通過熱激轉化，涂布到帶Amp抗性的LB平板上，37 ℃過夜培養，挑白色菌落，進行搖菌。通過SDS堿裂解法提取質粒DNA后，使用PCR進行檢測，檢測結果如圖2，表明所挑克隆全部正確。

2.3 測序結果分析

隨機選擇PCR檢測正確的克隆E1、E6和E9，送上海生工進行測序，結果表明只有E6正確，序列如下：

ZB03190283（E6）M13+_J_B10（19T-△DXR）GGGTTCCTTCGGTCAGTTGTATTAGACTCGGTACG

CGCGGATCTTCCAGAGATTGGATCCACATTGCCCT

GGCTAACAAGGAGACACTAATTGCTGGTGGTCCTT

TTGTTCTTCCTTTGGCGCAAAAGATAATGTTAAGA

TTTTGCCTGCTGATTCAGAACATTCTGCTATATTTC

AGTGTATACAAGGTTTGCCTGAGGGTGCTCTAAGG

CGTATTATTTTAACTGCATCTGGCGGTTCTTTCAGG

GATTGGCCTGTTGAGAAATTGAAAGAAGTTAAGG

TAGCAGATGCCTTGAAGCATCCCAATTGGAACAT

GGGGAAGAAGATTACCGTCGATTCTGAGAATCGT

CGAACGGCAGGCG

其中，加粗部分分別為酶切位點BamHI和XhoI，下劃線部分為GrDXR基因特異性片段△DXR。

3 討 論

在萜類生物合成過程中，DXR能夠催化DXP生產MEP，該反應能夠被來自于鏈霉菌的膦胺霉素所抑制[8]。由于DXR是龍膽苦苷生物合成途徑中的關鍵酶[4]，研究GrDXR基因功能，有助于龍膽苦苷生物合成途徑的解析，能夠為通過合成生物學途徑合成目標產物奠定基礎。同時，大多數細菌和頂福門寄生蟲都使用唯一的MEP途徑合成萜類化合物，而人類和動物使用甲羥戊酸途徑合成萜類，因此，研究害蟲和植物的DXR蛋白，有助于各種抗菌劑的研發。目前，DXR基因在弓形蟲[9]、鐵皮石斛[10]、玫瑰[11]、白木香[12]、丹參[13]、滇龍膽[5]等許多物種中已被克隆和研究，但是GrDXR基因的功能尚不清楚。探究一個基因功能，一般需要進行三方面的研究：（1）過表達，即讓目的基因在生物體內大量表達，檢測表型變化和生理生化變化；（2）敲除，即除去該基因，可以從DNA、RNA水平上進行移植或敲除，檢測表型變化和生理生化變化，RNAi技術是在RNA水平對基因表達進行抑制；（3）互補試驗，即將目的基因轉入該類基因的突變體，看是否能夠恢復野生型。RNAi方法屬于第二方面的研究，研究表明RNAi方法的優點是試驗周期較短，缺點是有時特異性不夠強[6]。在RNAi技術中，所選基因序列的特異性決定其干擾特異性與干擾效率[7]。本研究通過選取GrDXR基因片段，與滇龍膽轉錄組數據庫進行比對分析，獲得該基因特異性片段序列，從而保證了基因片段的特異性，并進行克隆，為通過RNAi技術研究GrDXR基因功能奠定基礎。

參考文獻：

[1]SUYAMA Y，TANAKA N，KAWAZOE K，et al.Rigenolides B and C，conjugates of norsecoiridoid and secoiridoid glucoside from Gentiana rigescens Franch[J].Tetrahedron letters，2017，58（15）：1459-1461.

[2]SUYAMA Y，KURIMOTO S I，KAWAZOE K，et al.Rigenolide a， a new secoiridoid glucoside with a cyclobutane skeleton， and three new acylated secoiridoid glucosides from Gentiana rigescens Franch[J].Fitoterapia，2013，91（10）：166-172.

[3]《云南名特藥材種植技術叢書》編委會編.滇龍膽[M].昆明：云南科技出版社，2013.

[4]ZHANG X，ALLAN A C，LI C，et al.De Novo assembly and characterization of the transcriptome of the Chinese medicinal herb， Gentiana rigescens[J].International journal of molecular sciences，2015，16（5）：11550-11573.

[5]張曉東，趙靜，李彩霞，等.滇龍膽1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶基因GrDXR的克隆、序列分析與原核表達[J].中草藥，2014，45（16）：2378-2384.

[6]翟中和，王喜忠，丁明孝.細胞生物學[M].北京：高等教育出版社，2011.

[7]KODAMA H，KOMAMINE A.RNAi and plant gene function analysis[M]. New York：Humana Press，2011： 1-35.

[8]HUI X，LIU H，TIAN F L，et al.Inhibition of green tea and the catechins against 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate reductoisomerase， the key enzyme of the MEP terpenoid biosynthetic pathway[J].Fitoterapia，2016，113：80-84.

[9]CAI G，DENG L，XUE J，et al.Expression， characterization and inhibition of Toxoplasma gondii 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase[J].Bioorganic & medicinal chemistry letters，2013，23（7）：2158-2161.

[10]FAN H H，WU Q J，WANG X，et al.Molecular cloning and expression of 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase and 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase in Dendrobium officinale[J].Plant Cell， Tissue and organ culture （PCTOC），2016，125（2）：381-385.

[11]WANG H，YAO L.Cloning and expression profile of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase gene from an oil-bearing rose[J].Russian journal of plant physiology，2014，61（4）：548-555.

[12]LIU J，XU Y，LIANG L，et al.Molecular cloning， characterization and expression analysis of the gene encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase from Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg[J].Journal of genetics，2015，94（2）：239-249.

[13]SHI M，LUO X Q，JU G H，et al.Increased accumulation of the cardio-cerebrovascular disease treatment drug tanshinone in Salvia miltiorrhiza hairy Roots by the enzymes 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase and 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate reductoisomerase[J].Functional & integrative genomics，2014，14（3）：603-615.