胸水γ干擾素特異性效應T細胞檢測對結核性胸膜炎診斷的價值評估

王 俊,戴亞新,劉 君,王盼盼,尚忠波,周希科,翟樺梓,歐勤芳,裴 豪

(無錫市第五人民醫院 結核病診斷實驗室，江蘇 無錫214005)

結核性胸膜炎(TBP)是由結核菌或其代謝產物進入胸膜腔，引起胸膜腔胸膜對結核毒素出現免疫反應引起滲出的結果，作為一種常見、多發的疾病，約占滲出性胸腔積液病因的54.8%[1]。目前結核性胸膜炎診斷的主要手段是影像學、胸腔積液細菌學檢查(抗酸染色涂片和結核分枝桿菌培養)、胸膜活檢等。細菌學檢查陽性檢出率低于5%～25%[2]，且檢測周期長，給臨床早期診斷帶來了困難。胸膜活檢被視為診斷結核性胸膜炎的金標準[3]，但由于此項技術的缺點是對患者有一定的創傷，因此不作為診斷結核性胸膜炎的常規手段。γ干擾素特異性效應T細胞檢測技術是近年來發展起來的一項新的診斷結核病的免疫學檢測技術，該方法通過檢測結核分枝桿菌(Mtb)特異性抗原刺激外周血單核細胞(PBMCs)γ干擾素(INF-γ)的分泌情況診斷結核桿菌的感染。本文通過比較外周血、胸水中結核分枝桿菌特異性抗原(CFP-10、ESAT-6)刺激特異性效應T細胞分泌INF-γ的斑點試驗(ELISPOT)，探討胸水檢測對結核性胸膜炎的診斷和鑒別診斷價值。

1 材料和方法

1.1研究對象

病例均來源于無錫市第五人民醫院結核科。實驗組：結核性胸膜炎組患者35例，男性31例，女性4例，年齡20-87歲，平均(62.5±21.4)歲，均為初治患者；對照組：腫瘤性或其他非結核炎性感染性胸膜炎患者40例，男性32例，女性8例，年齡24-83歲，平均(61.8±20.3)歲。上述患者均排除艾滋病感染。

入選標準：實驗組：①胸腔積液結核分枝桿菌抗酸染色涂片和(或)培養陽性，細菌培養陰性；②胸膜活檢符合結核表現；③臨床具備TBP的表現，如低熱、盜汗、乏力、胸悶、滲出性胸腔積液等，且抗結核治療有效。符合以上三條標準之一即可入組。對照組：①胸水為滲出液，結核分枝桿菌培養和(或)抗酸染色涂片陰性；②胸膜活檢排除結核且抗結核治療無效。符合以上兩項之一者可入組。

1.2方法

1.2.1標本采集 采集治療前患者靜脈血5 ml，同時留取患者新鮮胸腔積液50 ml，2 h內送檢，4 h內完成細胞分離。

1.2.2INF-γ的效應T細胞斑點試驗 根據試劑盒說明書(Oxford Immunote Ltd.，Oxford，UK)進行。分離外周血或胸水PBMCs，并將PBMCs濃度稀釋成2.5×106/ml的細胞終溶液。在有γ-干擾素抗體的微孔板上的4個孔中，依次加入細胞培養液50 μl作為陰性對照孔、結核分枝桿菌特異混合多肽ESAT-6抗原50 μl作為測試孔A、結核分枝桿菌特異混合CFP-10抗原50 μl作為測試孔B、植物血凝素50 μl作為陽性對照孔，然后在每孔中各加入100 ml細胞終溶液。在37℃，保持濕潤的含有5%的CO2培養箱中孵育16-20小時。后用PBS洗板4次，每個反應孔加入50 μl標記抗體工作液，4-8℃孵育1小時后洗板。加底物于常溫避光條件下顯色7分鐘后在顯微鏡下進行斑點計數。當滿足以下條件時判定為陽性結果：陰性對照孔斑點數為0-5個，測試孔A或B斑點數減去陰性對照孔斑點數≥ 6個；陰性對照孔斑點數6-10個，測試孔A或B斑點數必須≥2倍的陰性對照孔斑點數。如果不符合上述標準且陽性對照孔反應正常則檢測結果為陰性。

1.2.3胸水腺苷脫氨酶(ADA)檢測 采用酶動力學法。以奧林派斯5400全自動生化分析儀作為檢驗儀器，選用北京九強生物技術有限公司試劑盒，以腺苷脫氨酶>25 U/L作為陽性判定值。

2 結果

2.1結核組CFP-10與EST-6分別刺激外周血效應T細胞釋放INF-γ的斑點數為28.6±21.2，65.9±34.6，刺激胸水效應T細胞釋放INF-γ的斑點數為150.0±104.5,152.9±105.4(表1)。CFP-10與EST-6刺激胸水效應T細胞斑點數明顯高于刺激外周血效應T細胞釋放的斑點數，且具有統計學意義(P<0.001)(圖1)。

2.2通過 ROC 曲線分析得出，CFP-10與EST-6分別刺激外周血效應T細胞釋放INF-γ的斑點試驗曲線下面積分別為AUC=0.745，AUC=0.815。CFP-10與EST-6分別刺激胸水效應T細胞釋放INF-γ的斑點試驗曲線下面積分別為AUC=0.944，AUC=0.938。分析胸水ADA曲線下面積得出AUC=0.6(表1)。胸水效應T細胞釋放INF-γ的斑點試驗對于結核的診斷效果明顯高于外周血及胸水ADA檢測，特異性，敏感性都能達到90%以上。

表1 結核組CFP-10與EST-6分別刺激外周血/胸水效應T細胞釋放INF-γ的斑點數

注：*胸水、全血對應刺激物ESAT-6、CFP-10的T-spot．TB計數曲線下面積(ROC)的比較，P<0.001。

圖1 結核組：CFP-10與EST-6分別刺激外周血/胸水效應T細胞釋放INF-γ的斑點數

3 討論

IFN-γ釋放實驗(IGRAs)被認為是近年來結核病診斷方面的一個重大突破。IGRAs的診斷原理為：受到結核分枝桿菌抗原刺激而致敏的T細胞，再次遇到同類抗原時能產生IFN-γ，因此對全血或分離的外周血PBMC在結核分枝桿菌特異性抗原刺激后產生的IFN-γ進行檢測，從而判斷機體是否存在結核分枝桿菌病感染。該項技術具有較高的敏感性和特異性，且不受機體免疫力及卡介苗接種的影響，目前已被美國疾病控制預防中心(CDC)的最新指南中被推薦作為一種替代結核菌素皮試(TST)的檢測方法[4]。

結核分枝桿菌感染后細胞免疫應答起主要免疫應答作用，CD4+T淋巴細胞為優勢的免疫細胞亞群有向病灶遷徙的作用，并在感染部位產生保護性免疫應答，在病變局部發揮抗結核的免疫作用[5]。本文研究發現采用CFP-10與EST-6刺激胸水效應T細胞斑點數明顯高于刺激外周血效應T細胞釋放的斑點數，且具有統計學意義。通過ROC曲線分析

發現，胸水效應T細胞釋放INF-γ的斑點試驗對于結核的診斷效果明顯高于外周血及胸水ADA檢測，特異性、敏感性都能達到90%以上。表明應用γ干擾素特異性效應T細胞檢測對結核性和非結核性胸膜炎有鑒別診斷作用。

ADA是一種在淋巴細胞和淋巴組織中表達，并與機體細胞免疫活性密切相關的核酸代謝酶，在一些惡性疾病(如淋巴瘤)、感染性疾病、結締組織疾病侵犯胸膜時，胸腔積液中ADA水平也會升高[6]。本文結果顯示，胸水ADA ROC曲線下面積0.6，其特異性，敏感性遠不如胸水/外周血T-SPOT.TB實驗。

綜上所述，胸水γ干擾素特異性效應T細胞檢測對于結核性胸膜炎的診斷有著較高的敏感性和特異性，對于結核性胸膜炎患者和非結核性胸膜炎的早期診斷及鑒別診斷具有較高的臨床應用價值。

[1]孫家興，于文成，胡海燕，等.惡性胸腔積液與結核性胸腔積液的診斷進展[J].現代生物醫學進展，2013，13(14):2780.

[2]肖和平，高 文，唐神結． 臨床結核病學[M]．北京：人民衛生出版社， 2011：36-369.

[3]Kong XL,Zeng HH,Chen Y,et al. The visual diagnosis of tuberculous pleuritis under medical thoracoscopy:a retrospective series of 91 cases[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(10):1487.

[4]Mazurek GH,Jereb J,Lobue P,et al. Guidelines for using the QuantiFERON-TB Gold test for detecting Mycobacterium tuberculosis infection,United States[J].MMWR Recomm Rep,2005,54:49.

[5]Jafari C，Lange C．suttons’s 1aw；local immunodiagnosis of tuberculosis[J]．Infection，2008，36：510．

[6]Lee YM,Park KH,Kim SM,et al.Risk factors for false-negative results of T-SPOT. TB and tuberculin skin test in extrapulmonary tuberculosis[J]. Infection,2013,41(6):1089.