Periostin在大腸癌診斷中的應(yīng)用

喬 璐，鄭 嵐，楊照微*，何成彥，方 玲

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130021)

盡管近些年在結(jié)直腸癌的診斷方法和治療手段方面獲得了一定的進展[1]，仍然無法阻止該病死亡率逐步上升的腳步。統(tǒng)計結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌在發(fā)達(dá)國家中的常見性位列第三，在世界位列第二位[2-4]。許多局限性結(jié)直腸癌患者有微轉(zhuǎn)移的疾病通常在初次診斷中不能被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致診斷后數(shù)年疾病復(fù)發(fā)和死亡。因此，我們認(rèn)為找到一種與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)的標(biāo)志物，對于降低本病的新發(fā)病例數(shù)及死亡率至關(guān)重要。本研究將樣本分為腫瘤組織及距離腫瘤組織大于5 cm的癌旁正常組織作為對照組，通過二維質(zhì)譜色譜儀進行篩選：差異蛋白34個，13個上調(diào)蛋白。本實驗選定上調(diào)表達(dá)的骨膜蛋白Periostin作為研究對象。

1 材料與方法

1.1研究對象

收集年齡40-70歲之間的結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及其配對的癌旁組織(兩類標(biāo)本應(yīng)為相距10 cm以上的組織標(biāo)本)，男性17例，女性13例。

1.2主要試劑

考馬斯亮藍(lán)、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-HCL(pH8.8)、1.0M Tris-HCL(pH6.8)、碘代乙酰胺(IAM)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMED)、十二烷基磺酸鈉、蛋白質(zhì)定量試劑盒(RCDC Protein Assay Kit)購于Bio-Rad公司。測序級胰酶、二硫代蘇糖醇(DTT)。

1.3方法

(1)蛋白提取及濃度測定：取清洗干凈的組織標(biāo)本50 g，加入預(yù)冷的蛋白提取試劑中，在低溫環(huán)境下靜置20 min，高速低溫(12 000 rpm，4℃)離心1 h，棄掉沉渣取上清。考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法測定蛋白濃度，蛋白提取樣品保存于-80℃。(2)二維質(zhì)譜色譜聯(lián)用技術(shù)鑒定蛋白多肽：取酶切的蛋白水解多肽(蛋白∶胰酶=50∶1)溶解于0.1%FA，二維色譜分離條件設(shè)定為：流速2 μl/min，洗脫時間3 h。質(zhì)譜儀檢測條件：全掃描后附加10次二級掃描，碰撞能量：35%。(3)免疫印跡鑒定蛋白的表達(dá)：SDS-PAGE 電泳，經(jīng)濃縮膠、分離膠將蛋白按照分子量的不同進行分離，轉(zhuǎn)移分離的蛋白至醋酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，一抗(1∶1000 BSA稀釋)低溫孵育3 h，PBS洗膜/5 min,共計洗膜5次，每次5 min；二抗(1∶2000 BSA稀釋)室溫孵育，PBS洗膜/5 min,共計洗膜5次。化學(xué)法(ECL 法)發(fā)光顯色。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1質(zhì)譜分析結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白質(zhì)

將得到的圖譜數(shù)據(jù)進行分析比對，得到腫瘤組織中的蛋白豐度與癌旁組織的差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義的蛋白34個，其中Periostin蛋白質(zhì)譜結(jié)果見圖1。

圖1 Periostin蛋白中AAAITSDILEALGR序列肽段的串聯(lián)質(zhì)譜圖

2.2免疫印跡驗證蛋白Periostin

選取未經(jīng)治療的結(jié)直腸癌組織與癌旁組織，進行Western blotting檢測，結(jié)果如圖2所示：骨膜蛋白Periostin在腫瘤組織中的表達(dá)量高于癌旁正常組織。

A:大腸癌組織；B：大腸癌癌旁組織圖2 Periostin在大腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

3 討論

結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中排名第三[1,2]。多學(xué)科治療的進展極大地改善了被診斷為早期疾病的患者的預(yù)后，但是被確診患有晚期疾病的患者的預(yù)后依然很差[3]。在對人類多種腫瘤組織的研究中均觀察到了細(xì)胞粘附蛋白Periostin的蹤跡。 最近的幾項研究表明，肺癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌的血清骨膜素水平被上調(diào)[6]。數(shù)十位研究人員的研究結(jié)果向我們闡述了Periostin對于癌癥診斷具有一定的輔助作用。Periostin最初在成骨細(xì)胞中被確定為骨和牙齒形成和維持的重要調(diào)節(jié)者，目前，骨膜蛋白被認(rèn)為是一種異功能分泌細(xì)胞基質(zhì)外蛋白并與胚胎發(fā)育期間的細(xì)胞粘附和運動有關(guān)[7,8]。越來越多的證據(jù)表明，Periostin是一種基質(zhì)細(xì)胞蛋白，參與許多基本的生物過程，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和血管生成[9]。Periostin是膠質(zhì)瘤惡性腫瘤和潛在的腫瘤復(fù)發(fā)的強大標(biāo)志物。抑制Periostin后，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞致瘤性的消除為探索靶向Periostin的治療效果提供了支持[10]。本研究，通過二維質(zhì)譜色譜聯(lián)用技術(shù)與免疫印跡方法篩選并驗證了骨膜蛋白Periostin在結(jié)直腸癌中的上調(diào)表達(dá)。目前，研究雖然提示我們Periostin蛋白參與了細(xì)胞粘附和運動，同時與腫瘤的轉(zhuǎn)移及血運相關(guān)，此外在血清中也能夠檢測到Periostin的表達(dá)，我們推測正是由于Periostin的過量表達(dá)，一方面，促進了細(xì)胞之間的粘附，從而促進細(xì)胞的增殖；另一方面，高表達(dá)的Periostin增強了細(xì)胞的運動，進而促成了腫瘤的轉(zhuǎn)移。

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