頂空固相微萃取/GC-MS分析鑒定大蠟螟雄性信息素成分

劉位芬， 梁 鋮， 苗春輝， 楊 爽，2

(1.云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101； 2.山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801)

大蠟螟(GalleriamellonellaL.)屬鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)蠟螟亞科(Galleriinae)蠟螟屬(GalleriaFabricius)昆蟲，在我國1年發生2～5代，世代重疊，每個世代都經歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個發育階段，幼蟲(別稱巢蟲)以蜜蜂巢脾為食，容易在群勢較弱的蜂群和長時間存放不加以處理的巢脾上孳生，鉆蛀隧道、吐絲做繭、破壞巢脾，使蜜蜂幼蟲和蛹都受到傷害，造成大量“白頭蛹”，為害輕時，子脾受損、群勢減弱、產蜜量減少；為害嚴重時，擾亂蜜蜂在蜂群中的正常活動，使成蜂無法安身，導致蜂群(中華蜜蜂)飛逃，給養蜂生產造成嚴重的經濟損失[1-3]。

目前，防治大蠟螟的方法有物理的、化學的、生物的和飼養管理等。物理防治是對巢脾進行冷凍、冷藏、加熱和射線等處理，此法對貯存巢脾效果較好，但對設施要求較高；化學防治是采用硫磺、甲酸、乙酸、氯化鈣、二溴化乙烯、溴代甲烷及二氯苯等藥劑進行防治，長期用藥不符合蜂產品無公害生產的要求；在生物防治上主要采用蠟螟絨繭蜂、線蟲和蘇云金芽孢桿菌等寄生性天敵對大蠟螟幼蟲進行防治，但此法對大蠟螟成蟲不起作用；在飼養管理方面，通過保持蜂群強壯的群勢，定期清掃蜂箱、更換巢脾、安裝巢蟲阻隔器等措施，效果雖好但費工費時，不利于養蜂機械化和規模化生產，因此迫切須要尋求新的大蠟螟防治技術[4]。

利用昆蟲性信息素防治害蟲是一項極具前景的綠色防治技術，在國內外均已有成功實例，但在國內對防治大蠟螟方面還未見報道。對大蠟螟性信息素成分的研究已有報道，Roller等從大蠟螟雄蛾翅腺鑒定出第1種性信息素成分十一烷醛(n-undecanal)[5]；Leyrer等鑒定了第2種大蠟螟雄性信息素成分壬醛(n-nonanal)，并報道壬醛和十一烷醛的比率為 7 ∶3，該混合物能刺激引起大蠟螟雌蛾的求偶行為，壬醛在這一過程中占主導地位[6]；Schmidt等利用人工合成性信息素的方法進一步證實了壬醛和十一烷醛的存在，但蜂場試驗結果表明，按7 ∶3比例混合的壬醛和十一烷醛混合物并不能有效地引誘雌蛾，推測大蠟螟性信息素還含有其他成分[7]；Svensson等研究報道了第3種大蠟螟雄性信息素5，11-二甲基-二十五烷，并人工合成其4種立體異構物，但這3種雄性信息素的混合物吸引雌蛾水平依然遠低于自然狀態下雄蛾釋放性信息素的引誘力[8]。目前，國內有關大蠟螟性信息素成分的研究尚未見報道，但國外已有相關報道，例如，Lebedeva等研究報道俄羅斯不同地區間大蠟螟性信息素成分存在差異[9]。因此，本研究采用全自動頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction，簡稱HS-SPEM)和氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometer，簡稱GC-MS)法對山西省晉中地區大蠟螟外激素成分進行初步分析鑒定，以期為今后更好地利用性信息素對大蠟螟進行防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 大蠟螟雌、雄蛾由山西農業大學養蜂學實驗室提供，試驗前2 h取剛羽化的雌、雄蛾各10頭，剪去其翅膀(保持活體)，轉入20 mL頂空瓶中，密閉瓶口。

1.1.2 儀器 檢測試驗全部在山西農業大學實驗教學中心完成，儀器有美國Thermo Fisher公司氣相色譜-質譜聯用儀(Trace ISQ型GC-MS聯用儀)、美國CTC公司轉盤式自動進樣器(G6500型)、美國Supelco公司固相微萃取裝置，萃取纖維頭為65 μm PDMS/DVB。

1.2 方法

1.2.1 外激素成分的提取 檢測前先將PDMS/DVB萃取纖維在GC進樣口250 ℃老化1 h。自動進樣器條件為：50 ℃保持15 min，50 ℃吸附5 min，解吸附5 min，分析時間為 60 min，每個樣品重復2次。

1.2.2 GC-MS分析條件 HP-5MS彈性石英毛細管柱(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣，純度≥99.99%，柱流量為1.0 mL/min；升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至270 ℃，保持6 min；不分流進樣，進樣量為2 μL。MS條件：離子源溫度為 230 ℃，發射電流為34.6 μA，轉接口溫度為280 ℃，電子倍增器電壓為350 V，全掃描采集，采用氫火焰離子化檢測器(flame ionization detector，簡稱FID)進行檢測。

2 結果與分析

按照GC-MS分析條件分別對大蠟螟雌、雄蛾外激素揮發性成分進行分析，得到總離子流色譜(圖1、圖2)，外激素成分分析結果如表1、表2所示。通過GC-MS分析得到的質譜數據經計算機在標準譜庫進行檢索，得出分析報告(100個峰)，根據質譜匹配度分別對大蠟螟雌、雄蛾外激素組分進行核對(要求匹配率>20%)。

表1 大蠟螟雄蛾外激素組分的GC-MS分析結果

由表1可知，在大蠟螟雄蛾提取物中共鑒定出揮發物外激素成分8種，占總提取物的18.66%，其中酮類占8.29%(5種)，醇類占10.25%(2種)，醛類占0.12%(1種)；1種8碳化合物(1.18%)、3種9碳化合物(7.26%)、1種10碳化合物(0.65%)、2種11碳化合物(3.60%)、1種18碳化合物(5.97%)。由表2可知，在大蠟螟雌蛾提取物中鑒定4種揮發物外激素成分，占總提取物的1.29%，其中1種醇類，3種酮類，分別是乙醇(0.45%)、辛酮(0.34%)、壬酮(0.21%)和癸酮(0.29%)。

通過對比成分發現，雄蛾外激素種類和含量明顯較雌蛾

表2 大蠟螟雌蛾外激素組分的GC-MS分析結果

多；酮類外激素組分辛酮、壬酮和癸酮為大蠟螟雌、雄蛾共有組分；乙醇為雌蛾特有成分，但壬醛、十一烷醇(酮)和6，10，14-三甲基十五烷酮-2為大蠟螟雄蛾特有成分，鑒于昆蟲性信息素成分多為不飽和烴，推測壬醛、十一烷酮和6，10，14-三甲基十五烷酮-2為大蠟螟雄性信息素組分(分子結構如圖3)。

3 結論與討論

本研究通過頂空固相微萃取與GC-MS初步測定山西省晉中地區大蠟螟雌、雄蛾外激素揮發物成分的差異，經成分差異對比推測大蠟螟雄性信息素組分為壬醛(nonanal)、十一烷酮(醇)(2-undecanone)和6，10，14-三甲基十五烷酮-2(2-pentadecanone)，這與國外研究報道的大蠟螟雄性信息素成分[5-8]略有差異。在此次檢測中未檢測到十一烷醛(n-undecanal)和5，11-二甲基-二十五烷，但檢測出十一烷酮和十一烷醇，這可能與試驗中取樣時間和檢測條件不同有關。同時在試驗中檢測出壬醛與十一烷酮的量都較小，分別為 0.12%、0.27%，比率接近3 ∶7，這與Leyrer等研究報道的壬醛占主導地位的結論[6]不符，表明不同地區間大蠟螟性信息素組分存在一定的差異。對于國內外不同地區大蠟螟的種類及信息素成分的差異有必要進行深入研究。

目前，利用昆蟲性信息素防治害蟲是害蟲綜合治理對策的有效途徑之一，因其高效、無毒、無污染、不傷害天敵昆蟲，不會像化學農藥產生環境污染及“3R”現象，被稱為“第3代綠色農藥”，有著巨大的發展前景[10]。檢測中發現，6，10，14-三甲基十五烷酮-2的比率較高，達到5.97%，分別為壬醛和十一烷酮的49.75、22.11倍，推測6，10，14-三甲基十五烷酮-2在大蠟螟羽化初期發揮了重要作用。因此，在今后養蜂生產實踐中，可以針對6，10，14-三甲基十五烷酮-2這一雄性信息素設計引誘劑或驅避劑對大蠟螟雌蛾進行防控。

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