生物質(zhì)炭固定化融合菌株F14方法的研究及其對(duì)芘的去除

張 松 ，侯 彬 ，紀(jì)婷婷 ，劉 陽(yáng) ，黃 飛 ，秦梓菲 ，盧 靜 *

（1.中北大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，太原 030051；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

多環(huán)芳烴（PAHs）是一種廣泛存在的環(huán)境污染物，主要來(lái)源于有機(jī)材料的不完全燃燒[1]，其本身具有的半揮發(fā)性、低溶解性、難生物降解性使得其不易被去除[2]。根據(jù)苯環(huán)數(shù)量的不同，多環(huán)芳烴可以分為低環(huán)芳烴和高環(huán)芳烴，高環(huán)芳烴由于穩(wěn)定性和疏水性強(qiáng)，比低環(huán)芳烴具有更持久性[3]，而環(huán)境中存在的能夠以高分子量多環(huán)芳烴作為唯一碳源的微生物較少[4]，尋求高效修復(fù)高環(huán)芳烴的方法引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。芘作為一種四環(huán)多環(huán)芳烴，常被選為研究高環(huán)芳烴降解的模型化合物。

使用微生物修復(fù)環(huán)境中的多環(huán)芳烴被證明是最經(jīng)濟(jì)環(huán)保的[5]，但傳統(tǒng)的微生物修復(fù)存在生物可利用性低、容易受環(huán)境影響、與土著菌存在競(jìng)爭(zhēng)等問題[6]。固定化微生物作為一種綠色高效的修復(fù)方法，具有保護(hù)微生物、可重復(fù)使用、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[7]，與傳統(tǒng)生物修復(fù)相比效率更高[8]。近年來(lái)，固定化微生物技術(shù)在修復(fù)有毒化合物如原油[9]、苯酚[10]、蒽[11]、熒蒽[12]、多氯聯(lián)苯[13]等方面有著廣泛的應(yīng)用。

微生物的固定化可以通過很多方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，如吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合法，為了提高固定化顆粒的性質(zhì)，同時(shí)使污染物去除率更高，目前許多研究采用添加吸附劑而成的吸附-包埋-交聯(lián)的復(fù)合式固定化方法[6]。其中用作吸附固定化載體的材料多種多樣，如天然吸附基質(zhì)[14]、農(nóng)作物秸稈[9]、蜂窩煤渣[15]，生物質(zhì)炭是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種吸附劑，它是缺氧條件下，生物質(zhì)經(jīng)高溫?zé)峤獾漠a(chǎn)物，是一類富含碳的材料，具有較大的比表面積和豐富的孔隙結(jié)構(gòu)，并且制備生物質(zhì)炭的原材料來(lái)源廣泛[16-18]。研究表明生物質(zhì)炭是一種很有潛力的固定化材料，添加生物質(zhì)炭可以促進(jìn)受污染土壤的生物修復(fù)[19-21]。然而對(duì)生物質(zhì)炭的研究多集中于將生物質(zhì)炭直接添加于土壤促進(jìn)受污染土壤的生物修復(fù)[22-23]，本實(shí)驗(yàn)選擇將生物質(zhì)炭固定化融合菌株用于對(duì)芘的去除。

F14是以菲降解菌GY2B和芘降解菌GP3A為親本，通過原生質(zhì)體技術(shù)構(gòu)建而成的一株可以高效降解多環(huán)芳烴的融合菌株。F14對(duì)三環(huán)的菲具有比親本GY2B更高的降解能力（12 h對(duì)初始濃度為100 mg·L-1菲的降解率為99%），但是對(duì)四環(huán)的芘的降解能力較低（10 d對(duì)初始濃度為100 mg·L-1芘的降解率僅有18%）[24-25]。為了提高融合菌株F14對(duì)芘的去除效果，以便于后續(xù)在實(shí)際土壤中的應(yīng)用，本研究以不同溫度下玉米秸稈制得的生物質(zhì)炭為固定化材料，并添加聚乙烯醇和海藻酸鈉，對(duì)融合菌株F14進(jìn)行固定化，比較了添加不同溫度制備的生物質(zhì)炭的固定化小球的性質(zhì)，并探究了將固定化小球用于去除芘的效果及降解動(dòng)力學(xué)，旨在為固定化微生物技術(shù)高效修復(fù)環(huán)境中的芘提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

芘購(gòu)自西格瑪公司，純度為98%；聚乙烯醇（PVA）、無(wú)水氯化鈣、亞甲基藍(lán)均購(gòu)自天津光復(fù)試劑有限公司；海藻酸鈉（SA）和無(wú)水硫酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硼酸和正己烷購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

將無(wú)水硫酸鈉于馬弗爐中400℃灼燒4 h后放入干燥器內(nèi)備用，正己烷重蒸后使用，醫(yī)用脫脂棉用二氯甲烷抽提72 h，通風(fēng)櫥風(fēng)干后放入干燥器內(nèi)備用。

UV-6000PC型紫外-可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；Ultimate高效液相色譜儀（Thermo Scientific）；TriStar 3020 II型物理吸附儀（美國(guó) Micromeritics公司）；1027HT型超聲波清洗器（深圳市潔拓超聲波清洗設(shè)備有限公司）；RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司）；HC-3018高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；水浴恒溫振蕩器（天津市歐諾儀器儀表有限公司）；恒溫振蕩器（太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液（MSM）[26]：分別取5 mL磷酸鹽緩沖液（KH2PO48.5 g·L-1、K2HPO4·H2O 21.75 g·L-1、Na2HPO4·12H2O 33.4 g·L-1、NH4Cl 5.0 g·L-1）；3 mL MgSO4水溶液（22.5 g·L-1）；1 mL CaCl2水溶液（36.4 g·L-1）；1 mL FeCl3水溶液（0.25 g·L-1）；1 mL 微量元素（MnSO4·H2O 39.9 mg·L-1、ZnSO4·H2O 42.8 mg·L-1、（NH4）6Mo7O24·4H2O 34.7 mg·L-1），定容至 1 L，并將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為6.8～7.0。

本實(shí)驗(yàn)過程中所用到的玻璃器皿和溶液均在121℃下高壓蒸汽滅菌30 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 融合菌株F14的復(fù)壯

將融合菌株F14加入營(yíng)養(yǎng)肉湯中，32℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)，24 h后將營(yíng)養(yǎng)肉湯菌液離心10 min（6000 r·min-1），菌體用磷酸鹽緩沖液清洗3次并重新溶解于磷酸鹽緩沖液中，最終制得一定濃度的菌懸液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 生物質(zhì)炭的制備

將玉米秸稈烘干粉碎后填滿于密閉的熱解盒中，放入馬弗爐中通10～20 min氮?dú)猓謩e在300、500℃和700℃3種溫度下熱解2 h，冷卻至室溫后取出研磨過60目篩，儲(chǔ)存于干燥器中備用。

1.3.3 固定化材料比例的優(yōu)化

PVA和SA的混合載體機(jī)械強(qiáng)度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、傳質(zhì)性能較好，但是PVA和SA的濃度，以及二者的比例都會(huì)對(duì)固定化小球的性能造成很大影響。為了確定PVA和SA的最佳組合比例，選取PVA濃度為6%、8%和10%，SA濃度為 0.3%、0.5%和 1%進(jìn)行研究。

將不同濃度的PVA溶液和SA溶液分別于90℃水浴振蕩器和60℃水浴鍋中溶解，一段時(shí)間后將二者60℃混合于水浴振蕩器中繼續(xù)溶解，待溶液混合均勻停止溶解。當(dāng)混合液降至室溫，與滴入4%飽和硼酸的CaCl2水溶液交聯(lián)6 h，觀察交聯(lián)過程中小球的成球效果，同時(shí)測(cè)定交聯(lián)完成后小球的性能，以此來(lái)確定PVA和SA的最佳比例。

1.3.4 固定化微生物小球的制備

在上述確定的最優(yōu)PVA和SA條件下制備生物質(zhì)炭固定化小球：將300℃制備的一定量生物質(zhì)炭加入菌懸液中混合均勻，并與溶解好的PVA和SA的混合液進(jìn)行混合，室溫下靜置。一段時(shí)間后與滴入4%飽和硼酸的CaCl2水溶液交聯(lián)30 min，然后將形成的小球轉(zhuǎn)移至1 mol·L-1的無(wú)水硫酸鈉溶液繼續(xù)交聯(lián)6 h。交聯(lián)完成后用生理鹽水洗滌3次備用。分別用500℃和700℃制備的生物質(zhì)炭重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定各條件下小球的性能。

1.3.5 固定化小球性能的測(cè)定

直徑：用游標(biāo)卡尺測(cè)量不同條件下制備的固定化小球的直徑，每組小球測(cè)30顆，求平均值。

機(jī)械強(qiáng)度：將固定化小球浸泡在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，放于搖床上振蕩，10 d后觀察小球的破碎程度。

膨脹系數(shù)：測(cè)定固定化小球在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中振蕩10 d后小球的直徑，測(cè)得的平均直徑與原小球直徑之比即為膨脹系數(shù)。

傳質(zhì)性能：配制2%的亞甲基藍(lán)乙醇溶液（亞甲基藍(lán)溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用）。滴加配好的亞甲基藍(lán)乙醇溶液30滴于500 mL蒸餾水中，混合均勻后用于小球傳質(zhì)性能的測(cè)定。取此溶液分別加入固定化小球50顆放于搖床上振蕩，24 h后在波長(zhǎng)665 nm下，分別測(cè)定放小球的亞甲基藍(lán)溶液的吸光度和原亞甲基藍(lán)溶液的吸光度，比較測(cè)得的吸光度值大小，通過吸光度值的變化可間接反映固定化小球傳質(zhì)性能的好壞。

1.3.6 比表面積（BET）的測(cè)定

將不同條件下制備的固定化小球進(jìn)行冷凍干燥，利用TriStar 3020 II型物理吸附儀進(jìn)行液氮吸附脫附實(shí)驗(yàn)，測(cè)定小球的比表面積和孔徑。

1.3.7 掃描電鏡分析（SEM）

利用掃描電鏡觀察不同條件制備的小球的表面結(jié)構(gòu)。首先將各種方法制備的小球用磷酸鹽緩沖液清洗3次，然后在2.5%的戊二醛溶液中（4℃）固定化12 h以上，用不同濃度的乙醇溶液脫水后進(jìn)行真空冷凍干燥，并濺射鍍金膜，預(yù)處理完成的樣品被切開放置在JEOL JEM6490LV掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.8 固定化小球?qū)诺娜コ?/p>

將制備好的固定化小球加入初始濃度為50 mg·L-1的含芘無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)9個(gè)周期，每個(gè)周期10 d，測(cè)定其剩余芘濃度，并在一個(gè)周期后與游離菌進(jìn)行比較。由于實(shí)驗(yàn)過程中所用的芘濃度均大于芘在水中的溶解度（0.135 mg·L-1左右），因此芘的不溶性晶體在溶液中的分布是不均勻的，萃取時(shí)必須整瓶萃取。具體步驟為：（1）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別向錐形瓶中加入10 mL正己烷超聲萃取15 min，倒入分液漏斗，棄去水相收集有機(jī)相，該過程重復(fù)2次；（2）將收集的有機(jī)相過無(wú)水硫酸鈉；（3）放于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至1～2 mL；（4）定容到一定體積，用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。使用后的固定化小球用生理鹽水沖洗回收，重復(fù)使用。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化材料的最佳結(jié)合比例

將PVA和SA按不同比例組合后，對(duì)制備的固定化小球的性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)試。根據(jù)交聯(lián)過程中小球的成球效果，初步篩選出4組成球較好的小球，分別是6%PVA+1%SA、8%PVA+0.5%SA、8%PVA+1%SA 和10%PVA+0.5%SA。對(duì)這4組小球的傳質(zhì)性能和機(jī)械性能進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表1所示。4組小球在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中浸泡后都沒有破碎，其中8%PVA+1%SA和10%PVA+0.5%SA傳質(zhì)性能最好，綜合考慮小球的成球效果、傳質(zhì)性能和機(jī)械強(qiáng)度確定8%PVA+1%SA為最佳比例，在此條件下制得的固定化小球呈規(guī)則球形，大小均勻，如圖1所示。

表1 不同固定化材料比例小球的性能Table 1 Performance of immobilized microbial beads

圖1 固定化微生物小球外觀效果Figure 1 The appearance images of the immobilized microorganism beads

2.2 不同生物質(zhì)炭制備的固定化小球的性能分析

無(wú)生物質(zhì)炭和不同溫度下制備的生物質(zhì)炭的固定化小球的直徑、機(jī)械性能和傳質(zhì)性能如表2所示。由表2可以看出，所有條件下制備的小球的直徑無(wú)明顯差別，大約為3 mm左右。這比Huang等[27]用煤渣包埋芘和苯并芘降解菌制備的小球的直徑（6～8 mm）明顯低。而有研究表明，粒徑越小降解率越高[28]。同時(shí)，所有固定化小球均能保持良好的機(jī)械性能，即在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中振蕩10 d后沒有任何破碎，滿足了小球在生物處理廢水中需要的高穩(wěn)定性[29]。可以發(fā)現(xiàn)，在加入生物質(zhì)炭后，小球的膨脹系數(shù)有了略微的下降，而膨脹系數(shù)越低，小球的穩(wěn)定性越好[30]。與不添加生物質(zhì)炭的小球相比，添加生物質(zhì)炭制備的固定化小球傳質(zhì)性能明顯提高，其中700℃制備的生物質(zhì)炭效果最好。

表2 固定化微生物小球的性能Table 2 Performance of immobilized microbial beads

2.3 不同生物質(zhì)炭制備的固定化小球的表面形態(tài)及孔結(jié)構(gòu)分析

分別對(duì)不同固定化小球的表面性質(zhì)和孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行了考察，結(jié)果如表3所示。添加生物質(zhì)炭后小球的比表面積都有不同程度的提高，其中添加700℃生物質(zhì)炭制備的小球比表面積最大，孔徑最小，有利于微生物和載體基質(zhì)的接觸，同時(shí)對(duì)有機(jī)物也有較好的吸附性能，進(jìn)而提高了微生物對(duì)有機(jī)物的去除率。

小球的SEM圖如圖2所示，很明顯可以發(fā)現(xiàn)添加生物質(zhì)炭的小球表面比不添加生物質(zhì)炭的小球更粗糙，更有利于微生物的吸附。結(jié)合表3的比表面積和圖2的微觀結(jié)構(gòu)圖可以得出700℃生物質(zhì)炭表面凹凸不平、比表面積最大，有利于吸附。因此，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)選擇700℃生物質(zhì)炭做進(jìn)一步研究。

2.4 芘去除效果的研究

2.4.1 游離菌和固定化菌對(duì)芘的去除

實(shí)驗(yàn)研究了游離菌、固定化菌和不含微生物的生物質(zhì)炭空白小球?qū)Τ跏紳舛葹?0 mg·L-1芘的去除，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，固定化菌對(duì)芘的去除明顯高于游離菌，游離菌對(duì)芘的去除率只有37.38%，而固定化菌的去除效率最高可達(dá)到94.91%。這可能是由于固定化載體可以為微生物的生長(zhǎng)提供更好的場(chǎng)所，同時(shí)能夠使細(xì)胞保持更高的活性。比較固定化菌和空白小球?qū)诺娜コ梢钥闯隹瞻仔∏驅(qū)啪哂形阶饔茫椅皆谛∏蛏系能趴梢员籉14降解，因此推測(cè)固定化小球?qū)诺娜コ且揽课胶蜕锝到獾膮f(xié)同作用。除此之外，為了評(píng)估瓶壁和細(xì)胞對(duì)芘的吸附作用，設(shè)置控制組實(shí)驗(yàn)研究無(wú)細(xì)胞和滅活細(xì)胞對(duì)初始濃度為50 mg·L-1芘的去除，結(jié)果表明芘的消耗僅有4.60%和6.03%，可以忽略不計(jì)。

表3 固定化微生物小球的比表面積和孔結(jié)構(gòu)Table 3 Special surface area and porosity of immobilized microbial beads

圖3 芘降解曲線Figure 3 Curves of pyrene degradation

2.4.2 融合菌株F14降解芘的動(dòng)力學(xué)方程

為了更好地研究游離菌和固定化菌對(duì)芘的降解，本實(shí)驗(yàn)將游離菌和固定化菌分別投加到初始濃度為50 mg·L-1的含芘無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，通過測(cè)定不同降解時(shí)間下芘的濃度，計(jì)算游離菌和固定化菌對(duì)芘的降解動(dòng)力學(xué)。Monod方程是歷史上首先提出并且被廣泛接受的動(dòng)力學(xué)方程[31]。其中底物降解速度與底物濃度之間的關(guān)系式為：

式中：v為底物降解速度；c為底物濃度；Ks為飽和常數(shù)，又稱半速度常數(shù)。

當(dāng)c＞＞Ks時(shí)，降解過程遵循零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，底物與時(shí)間的關(guān)系式為：

當(dāng)c＜＜Ks時(shí)，降解過程遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，底物與時(shí)間的關(guān)系式為：

式中：c為底物濃度；t為降解時(shí)間；k0和k1分別為零級(jí)和一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)降解速度常數(shù)；a和b為常數(shù)。

對(duì)游離菌和固定化菌對(duì)芘降解的數(shù)據(jù)分別按一級(jí)反應(yīng)和零級(jí)反應(yīng)方程形式擬合，線性擬合得出，其降解曲線均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，其中動(dòng)力學(xué)方程、模型參數(shù)k及半衰期結(jié)果如表4所示。由表可以看出，固定化菌對(duì)芘的降解速率明顯高于游離菌。

表4 游離菌和固定化菌對(duì)芘降解的一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table 4 Parameters and statistical indexes of the first-order kinetic model for pyrene degradation by free cells and immobilized microbial beads

2.4.3 固定化小球用于去除芘的使用次數(shù)

小球9個(gè)周期的10 d去除率重復(fù)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，前8個(gè)周期小球的去除率下降得非常緩慢，前8個(gè)周期去除率能達(dá)到80%以上，說明小球去除效果較好，可以重復(fù)使用。8個(gè)周期后小球的去除效率急劇下降，可能由于前8個(gè)周期的使用，使小球內(nèi)降解菌的活性下降，載體材料的吸附性下降，吸水后小球內(nèi)部空隙率變小等原因?qū)е隆?/p>

圖4 固定化小球重復(fù)使用率Figure 4 Repeated times of immobilized beads

3 結(jié)論

（1）研究以由菲降解菌GY2B和芘降解菌GP3A融合而成的菌株F14為微生物進(jìn)行固定化，確定了載體PVA和SA的最佳組合比例為8%和1%。

（2）以300、500℃和700℃制備的生物質(zhì)炭為吸附劑，采用“吸附-包埋-交聯(lián)”的復(fù)合式固定化方法制備固定化微生物小球，并比較了固定化小球的性能，其中700℃制備的生物質(zhì)炭的固定化小球性能較好。

（3）與游離菌相比，固定化菌對(duì)芘的去除效率明顯較高，且符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律；而固定化小球可以重復(fù)使用高達(dá)9次。

[1]Abdel-Shafy H I,Mansour M S M.A review on polycyclic aromatic hydrocarbons：Source,environmental impact,effect on human health and remediation[J].Egypt JPetrol,2015,3（11）：1-17.

[2]Li X J,Tong D L,Graeme A,et al.Adsorption of pyrene onto the agricultural by-product：Corncob[J].Bull Environ Contam Toxicol,2016,96（1）：113-119.

[3]Xu H X,Li X H,Sun Y Y,et al.Biodegradation of pyrene by free and immobilized cells of Herbaspirillum chlorophenolicum Strain FA1[J].Water Air Soil Pollut,2016,227（4）：1-12.

[4]Wang S X,Li X J,Liu W,et al.Degradation of pyrene by immobilized microorganisms in saline-alkaline soil[J].Journal of Environmental Sciences,2012,24（9）：1662-1669.

[5]Saurabh J S,Kannan P.Surfactant aided biodegradation of pyrene using immobilized cells of Mycobacterium frederiksbergense[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2011,65（1）：73-77.

[6]李 婧.以玉米秸稈吸附-包埋-交聯(lián)的復(fù)合固定化方法固定微生物處理芘的研究[D].廣州：華南理工大學(xué),2012.LI Jing.Removal of pyrene by immobilized microorganism using preadsorption on corn stalk-embedding-crosslinking immobilization method[D].Guangzhou：South China University of Technology,2012.

[7]Muftah H E,Mourad A H,Riham S.Evaluation of the characteristics of polyvinyl alcohol（PVA）as matrices for the immobilization of Pseudomonas putida[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2013,85：413-420.

[8]Wang J L,Quan X C,Han L P,et al.Microbial degradation of quinoline by immobilized cells of Burkholderiapickettii[J].Water Research,2002,36（9）：2288-2296.

[9]童 樂,何麗媛,郭楚玲,等.以農(nóng)作物秸稈固定化混合菌去除原油[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2016,10（5）：2707-2713.TONG Le,HE Li-yuan,GUO Chu-ling,et al.Degradation of crude oil using mixed bacteria immobilized by straw[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2016,10（5）：2707-2713.

[10]Park M R,Kim D J,Choi J W,et al.Influence of immobilization of bacterial cells and TiO2on phenol degradation[J].Water,Air and Soil Pollution,2013,224（3）：1473.

[11]Xie H,Liu H Y,Xie Y Q,et al.Fabrication of a novel immobilization system and its application for removal of anthracene from soil[J].Biochemical EngineeringJournal,2015,97（6）：8-16.

[12]Xie H,Chen Y J,Wang C,et al.The removal of fluoranthene by Agaricus bisporus immobilized in Ca-alginate modified by Lentinus edodes nanoparticles[J].RSC Advances,2015,5（56）：44812-44823.

[13]胡金星,蘇曉梅,韓慧波,等.固定化微生物技術(shù)修復(fù)多氯聯(lián)苯污染土壤的應(yīng)用前景[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2014,25（6）：1806-1814.HU Jin-xing,SU Xiao-mei,HAN Hui-bo,et al.Application prospect about bioremediation of polychlorinated biphenyls-contaminated soil with immobilized microorganism technique：A review[J].Chinese Journal of Applied Ecology,2014,25（6）：1806-1814.

[14]劉金苓,鐘玉鳴,王麗嬌,等.厭氧氨氧化微生物的吸附、包埋固定化效果初探[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2010,30（3）：470-476.LIU Jin-ling,ZHONG Yu-ming,WANG Li-jiao,et al.Preliminary study on nitrogen removal with anaerobic ammonium oxidizing（ANAMMOX）bacteria immobilized in absorbent and entrapping materials[J].ActaScientiae Circumstantiae,2010,30（3）：470-476.

[15]余美瓊,楊金杯,陳文韜,等.改性蜂窩煤渣吸附Cr（Ⅵ）的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)性能[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2013,7（12）：4741-4747.YU Mei-qiong,YANG Jin-bei,CHEN Wen-tao,et al.Adsorption kinetics and thermodynamics of Cr（Ⅵ）on modified honeycomb-cinder[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2013,7（12）：4741-4747.

[16]Sardar K,Muhammad W,Ding F H,et al.The influence of various biochars on the bioaccessibility and bioaccumulation of PAHs and potentially toxic elements to turnips（BrassicarapaL.）[J].Journal of Hazardous Materials,2015,300：243-253.

[17]Aabid H L,Ghulam R N,Mumtaz A G,et al.Biochar for sustainable soil health：A review of prospects and concerns[J].Pedosphere,2015,25（5）：639-653.

[18]Deng F C,Liao C J,Yang C,et al.Enhanced biodegradation of pyrene by immobilized bacteria on modified biomass materials[J].International Biodeterioration and Biodegradation,2016,110：46-52.

[19]Cao Y N,Yang B S,Song Z H,et al.Wheat straw biochar amendments on the removal of polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）in contaminated soil[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2016,130：248-255.

[20]Rajapaksha A U,Chen S S,Zhang M,et al.Engineered/designer biochar for contaminant removal/immobilization from soil and water：Potential and implication of biochar modification[J].Chemosphere,2016,148：276-291.

[21]Chen B L,Yuan M X,Qian L B.Enhanced bioremediation of PAH-contaminated soil by immobilized bacteria with plant residue and biochar as carriers[J].JSoils Sediments,2012,12（9）：1350-1359.

[22]Chinedum A,Zaiton A M,Zahara I,et al.The impact of biochars on sorption and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soils：A review[J].Environ Sci Pollut Res,2015,22（5）：3314-3341.

[23]Carlos G D,Irene A B,Enrique E.Combination of biochar amendment and mycoremediation for polycyclic aromatic hydrocarbons immobilization and biodegradation in creosote-contaminated soil[J].Journal of Hazardous Materials,2015,285：259-266

[24]Lu J,Guo C L,Zhang M L,et al.Biodegradation of single pyrene and mixtures of pyrene by a fusant bacterial strain F14[J].International Biodeterioration and Biodegradation,2014,87：75-80.

[25]Lu J,Guo C L,Li J,et al.A fusant of Sphingomonas sp.GY2B and Pseudomonas sp.GP3A with high capacity of degrading phenanthrene[J].World JMicrobiol Biotechnol,2013,29（9）：1685-1694.

[26]盧 靜.融合菌株F14的構(gòu)建及其降解多環(huán)芳烴的性能研究[D].廣州：華南理工大學(xué),2012.LU Jing.Construction of fusant strain F14 and performance study on degrading PAHs[D].Guangzhou：South China University of Technology,2012.

[27]Huang R Y,Tian W J,Liu Q,et al.Enhanced biodegradation of pyrene and indeno（1,2,3-cd）pyrene using bacteria immobilized in cinder beads in estuarine wetlands[J].Marine Pollution Bulletin,2016,102（1）：128-133.

[28]Nedal M,Abraham S,Isam S.Modeling the effect of immobilization of microorganisms on the rate of biodegradation of phenol under inhibitory conditions[J].Water Research,2010,44：5252-5259.

[29]Takayuki T,Kaoru I,Hiroyuki I,et al.Fabrication of poly（vinyl alcohol）hydrogel beads crosslinked using sodium sulfate for microorganism immobilization[J].Process Biochemistry,2011,46（2）：566-571.

[30]Takayuki T,Kaoru I,Hiroyuki I,et al.A comparison of sodium sulfate,sodium phosphate,and boric acid for preparation of immobilized Pseudomonas putida F1 in poly（vinyl alcohol）beads[J].Polym Bull,2012,69（3）：363-373.

[31]甄麗莎,谷 潔,胡 婷,等.石油烴類污染物降解動(dòng)力學(xué)和微生物群落多樣性分析[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2015,31（15）：231-238.ZHEN Li-sha,GU Jie,HU Ting,et al.Kinetics of petroleum hydrocarbon degradation in soil and diversity of microbial community during composting[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering,2015,31（15）：231-238.