自動QuEChERS方法結合液相色譜串聯質譜對玉米中133種農藥的多殘留分析

王濟世,賀澤英,徐亞平,王 璐,彭 祎,劉瀟威

（農業部農產品質量安全環境因子控制重點實驗室/農業部環境保護科研監測所，天津 300191）

玉米是重要的糧食作物和重要的飼料來源。在現代農業生產中，為了減少病蟲草害[1-2]，保證玉米產量，不可避免地需要使用農藥[3]。然而，當食用農產品中的農藥殘留量超過一定水平，就可能會對人類的健康造成危害[4-5]。為了保障農產品質量安全和食用者身體健康，我國明確規定了食品中的農藥最高殘留限量（MRLs）。快速檢測農產品中農藥殘留是保證食品安全的重要手段，而快速、簡便、靈敏的分析方法，將成為農藥殘留檢測的主要目標[6]。

Anastassiades等[7-8]在2003年首次提出了QuECh-ERS（快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全）方法，并對其在農藥多殘留檢測中的簡便性和廣泛適用性進行了驗證，現已得到廣泛認可。該方法主要分為兩個步驟：提取和凈化。在基質前處理過程中常用乙腈作為提取溶劑，并加入專用萃取鹽包去除基質中的水分等干擾物，離心后將上清液轉移至凈化材料中，利用分散固相萃取技術進行凈化[9]。為了使QuEChERS方法適用范圍更廣，研究人員不斷對提取溶劑，凈化材料等步驟進行改進和完善[10-13]。

目前，國外也研究開發了一些自動化比較強的QuEChERS方法，但價格昂貴。而我國本立科技公司新研發的自動QuEChERS前處理設備價格低，簡單快捷，具有很好的應用前景。本研究在QuEChERS方法的基礎上，借助自動QuEChERS前處理設備，建立了一個更加簡單、便捷的方法——高通量自動QuECh-ERS方法。為保證方法的適用性，在自動QuEChERS方法建立過程中，選擇了基質較復雜的谷物——玉米進行添加回收實驗，結合LC-MS/MS進行檢測，并對該方法的實用性進行了驗證。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

乙腈、甲醇（色譜純，Fisher）；乙酸（優級純，中國國藥集團化學試劑有限公司）；實驗用水為實驗室一級水；EN法（歐盟標準）萃取鹽包（美國Agilent公司）：內含4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉；AOAC法（美國標準）萃取鹽包（美國Agilent公司）：內含6 g無水硫酸鎂，1.5 g醋酸鈉；陶瓷均質子（美國Agilent公司）；凈化材料：無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺（PSA）及C18150 mg（美國Agilent公司）；鋯珠（R101、R104）和雙層提取凈化管（本立科技公司）；針管式過濾膜（0.22 μm，美國 Agilent公司）。

農藥標準溶液（美國Chem Service公司和德國Dr.Ehrenstorfer公司），純度大于98%。將133種農藥標準溶液用丙酮作溶劑配成5 mg·L-1混標溶液，-20℃儲存備用。

玉米面粉購自天津市的超市。

1.2 儀器

渦旋振蕩器（Thermo，美國）；高速冷凍離心機（Heal Force，香港）；Qtrap 4500三重四級桿質譜儀和Acquity LC100高效液相色譜儀（美國AB Sciex公司）；C18色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）購于美國Waters公司。

1.3 自動前處理設備

自動QuEChERS前處理設備是一款自動程序控制分析樣品制備的設備，利用強力立體“8”字振蕩造成渦旋效果，實現提取效能；再與電機單向運動實現的離心功能相結合，來完成樣品中待測成分的提取和凈化。與配套提取管組合，開發出全新的自動QuEChERS處理方法，其流程示意圖見圖1。

自動QuEChERS前處理設備專用提取管由內外兩層管組成，內管側壁開若干小孔，孔上覆有只允許提取溶劑通過的半透性微孔膜。使用時，先將樣品加入外管，再加入提取劑，并放入鋯珠，將裝有凈化材料的內管插入外管內，擰緊放入提取儀中。儀器自動順序實現兩次振蕩和離心。振蕩時，在鋯珠的幫助下，樣品與提取劑充分接觸混合。當振蕩提取結束，開始離心時，樣品受到離心力的作用，提取液與提取殘渣分離，提取液透過微孔濾膜進入到內管，迅速得到潔凈的上清液，再經過二次振蕩與凈化劑充分作用得到凈化。圖2為提取管的抑制滲透效果及對實際樣品的處理效果。

1.4 檢測條件

1.4.1 液相條件

柱溫40℃，流動相A為甲醇，流動相B為0.2%醋酸銨，進樣量 5 μL，流速 0.3 mL·min-1。梯度洗脫程序見表1。

上式中，和分別表示非耐用品與耐用品的價格；Ht表示消費者新購買的耐用品；Bt表示無風險債券；與分別表示非耐用品部門與耐用品部門名義工資；與表示消費者在非耐用品部門與耐用品部門的就業；Rt表示名義利率；為物質資本租金率；常量K表示物質資本，與Barsky et al. 相同，[17]我們將物質資本設定為常數，原因在于任意時期經濟中可供使用的物質資本數量是一定的(取決于上一時期末物質資本存量)；Ot表示消費者獲得的其他收入。定義δ為耐用品的折舊率，耐用品Dt的動態積累過程為：

1.4.2 質譜條件

氣簾氣（CUR）25 psi（1 psi=6.895 kPa），碰撞活化參數（CAD）中等，離子噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度500℃，離子源氣體1（GS1）50 psi；離子源氣體2（GS2）50 psi。目標化合物的保留時間、離子對、去簇電壓、碰撞能質譜條件見表2。

1.5 樣品的制備

EN法：（1）稱取玉米樣品5 g于離心管外管中，加入混標溶液（外標法），靜置30 min；（2）加入10 mL水渦旋混勻，靜置 30 min；（3）加入10 mL乙腈，加入EN萃取鹽包及10顆鋯珠，擰緊內管（內含無水硫酸鎂 450 mg，PSA 75 mg，C1875 mg）；（4）放入自動QuEChERS前處理設備開始處理。處理結束后從內管中取清液1 mL過0.22 μm微孔濾膜，待測。

圖1 自動QuEChERS方法流程示意圖Figure 1 Diagram of automated QuEChERS method

圖2 提取管的抑制滲透效果圖Figure 2 Diagram of double centrifuge tubes prevent the osmosis

表1 流動相梯度洗脫參數Table 1 The gradient elution procedure of mobile phase

AOAC法：與EN法不同的是（3）加入10 mL乙腈（含1%乙酸），加入AOAC萃取鹽包及10顆鋯珠，擰緊內管（內含無水硫酸鎂600 mg、PSA 200 mg、C18200 mg）；其他步驟相同。

2 結果與討論

2.1 提取時間的優化

為了探索最優的提取時間，對均質分離工作站第一階段的振蕩時間進行優化比較。本實驗將第一階段振蕩時間分別設置1、2、3 min進行對比，轉速1000 r·min-1，保持后面三個階段處理時間不變：第二階段離心 5 min，轉速 4000 r·min-1；第三階段振蕩 3 min，轉速1000 r·min-1；第四階段離心3 min，轉速4000 r·min-1。結果如圖3所示，當第一階段的振蕩時間為2 min和3min時，回收率相近。基于效率最優化，第一階段的振蕩時間定為2 min。實驗過程中，對第二至第四階段離心振蕩時間也進行了優化，但對結果影響不大。

2.2 提取方法的比較

實驗對兩種提取方法（EN和AOAC）進行了比較。從兩種方法得到的色譜圖（圖4）可以發現，兩種方法提取效果差異不大。但AOAC方法提取溶劑中需加入1%的乙酸，且凈化材料用量較大，所以本實驗采用EN提取方法。

2.3 與傳統QuEChERS方法的比較

本研究將自動QuEChERS方法與傳統QuECh-ERS方法進行了回收率的比較。傳統方法步驟：準確稱取5 g玉米于50 mL離心管中，加入混標溶液，靜置30 min，加入10 mL水渦旋混勻，靜置30 min，加入10 mL乙腈。加入EN萃取鹽包及1顆陶瓷均質子，擰緊蓋子，劇烈振蕩1 min，于8000 r·min-1下離心5 min，取6 mL上清液到凈化用離心管中，渦旋混勻1 min，于 8000 r·min-1下離心5 min。取上清液1 mL過0.22 μm微孔濾膜，待測。圖5給出了兩種方法在3個添加濃度下的回收率比較。從圖中可以看出，自動QuEChERS方法與傳統QuEChERS方法回收率相差不大，幾乎所有受測農藥回收率在70%～120%之間，通過兩種方法的比較，進一步說明了自動QuEChERS方法在玉米農藥多殘留分析中的可行性和適用性。

表2 目標化合物的質譜參數Table 2 Optimized chromatographic parameters for the selected antibiotics

續表2目標化合物的質譜參數Continued table 2 Optimized chromatographic parameters for the selected antibiotics

續表2目標化合物的質譜參數Continued table 2 Optimized chromatographic parameters for the selected antibiotics

圖3 不同振蕩時間下玉米中133種農藥的回收率比較Figure 3 Recoveries of 133 pesticides in corn at different oscillation time

圖4 EN和AOAC提取方法得到的玉米提取化合物色譜圖Figure 4 The chromatogram of corn extracts using EN and AOAC method

2.4 基質效應

圖5 傳統方法和自動方法在3個添加水平時的回收率箱圖Figure 5 Boxplot of the recovery values obtained with the manual method and automatic method at three spiking level

式中：Sm和Ss分別表示基質標曲和溶劑標曲的斜率，當ME為-20%～20%、-50%～-20%或 20%～50%、＜-50%或＞50%時，分別表示輕微、中等、較強的基質效應。本研究基質效應（圖6）的評估結果表明，69%受測農藥基質效應在-20%～20%，屬于弱基質效應；而溴氰菊酯、芐氯菊酯等農藥表現為中等或強基質效應，所以在定量分析中使用基質標準校正曲線是必要的。

2.5 方法驗證

在實驗中，通過回收率、線性、定量限對自動QuEChERS方法進行了驗證。

待測農藥 3 個添加濃度為 20、100、500 μg·kg-1，每一濃度5個平行，得到的回收率在70%～120%，相對標準偏差低于15%。

用玉米空白基質配制 8個濃度水平（2、5、10、20、50、100、200、500 μg·kg-1），通過液相色譜-串聯質譜得標準工作曲線，呈現良好的線性，相關系數在0.990～0.999。

圖6 在玉米基質中受測農藥的基質效應Figure 6 Matrix effects（ME）of the test pesticides in corn

本實驗以目標化合物回收率在70%～120%、相對標準偏差小于20%時的最小添加濃度為定量限，在對玉米133種農藥檢測結果中，有119種農藥的定量限為 2 μg·kg-1，相比 He 等[16]所報道的更低。

2.6 實際樣品測定

對山東省10個玉米樣品（S-1～S-10），采用自動QuEChERS方法進行農藥殘留測定。其中S-3、S-5、S-6、S-9中未檢出農藥殘留，S-1中莠去津、乙草胺有檢出，濃度分別為 20.8 μg·kg-1和 10.1 μg·kg-1；S-2中乙草胺檢出濃度為6.2 μg·kg-1，毒死蜱檢出濃度低于檢出限；S-4 檢出甲草胺 16.2 μg·kg-1，毒死蜱2.7 μg·kg-1，S-7 檢出甲草胺 4.2 μg·kg-1，三唑酮 3.1 μg·kg-1，除蟲脲 2.7 μg·kg-1，克百威低于檢出限；S-8中檢出莠去津、氯蟲苯甲酰胺濃度分別為9.8、4.6 μg·kg-1；S-10 中檢出 3-羥基克百威 2.9 μg·kg-1，莠去津8.3 μg·kg-1。結果表明，本方法適用于玉米中農藥殘留的測定。

3 結論

（1）在本研究中，通過對提取方法的比較、提取時間的優化，以及方法的驗證，建立了自動QuEChERS結合液相色譜-串聯質譜對玉米中133種農藥的多殘留分析方法。

（2）通過與傳統QuEChERS方法的比較，該方法耗時短、效率高，受測農藥總體回收率在70%～120%之間，相對標準偏差在15%以下，符合殘留檢測的要求。

（3）該方法成功應用于玉米實際樣品的檢測，為玉米中農藥多殘留檢測提供方法依據。

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