豬糞厭氧發酵消化液回流體系微生物群落結構特征與產氣關系研究

孔德望，張克強 ，房 芳，高文萱，梁軍鋒 ，梁 雨，杜連柱*

（1.沈陽農業大學土地與環境學院，沈陽 110866；2.農業部環境保護科研監測所，天津 300191；3.天津環科源環保科技有限公司，天津 300191）

隨著我國養殖業集約化、規?；目焖侔l展，畜禽糞便產量逐年增加，正確處理和利用養殖廢棄物已成為養殖業健康良性發展的關鍵因素。厭氧消化因其工藝相對簡單、活性污泥量少而逐漸成為有機廢棄物處理的主要技術之一，在畜禽養殖廢棄物處理和資源化利用中得到越來越廣泛的應用。

厭氧消化性能受溫度、pH、有機負荷、回流等眾多因素的影響，其中消化液的回流能夠減少微生物流失和沼液排放量、提高發酵體系的緩沖能力、緩解沼液后續深度處理的壓力[1]。Estevez等[2]研究了消化液回流對牛糞和汽爆過的沙柳混合半連續厭氧發酵的作用，結果表明，1∶1的回流比能夠提高沼氣中的甲烷含量，同時甲烷產率提高16.0%。吳樹彪等[3]在牛糞的厭氧發酵研究中發現，固液分離后的消化液回流使基質的產甲烷率提高16.3%，但隨著回流的進行，日產甲烷量呈下降趨勢。Nordberg等[4]的研究結果表明，消化液回流能夠增加青貯苜蓿厭氧發酵體系的pH、堿度和穩定性。高新星等[5]對比了固體產酸發酵反應器中消化液浸泡和噴淋兩種回流方式對豬糞和秸稈混合原料兩相厭氧消化性能的影響，發現在消化液浸泡回流方式下累積產氣量是噴淋回流的2倍，而且穩定性更好，單位質量總固體產氣量可達217.88 mL·g-1。

以往的研究主要針對固液分離后的消化液回流，重點集中在對產氣性能的影響，對消化液直接回流及直接回流過程中微生物的群落變化及其與產氣之間的關系研究不足。鄧遵等[6]研究了ABR反應器出水回流對微生物種群的影響，結果表明，與不回流相比，回流反應器中真細菌、古細菌、產氫產乙酸菌和耗氫產乙酸菌的相對豐度分別高出8.5%、4.5%、3.5%和3.0%。Zamanzadeh等[7]研究了消化液回流對食品廢水厭氧消化中微生物的影響，結果表明，中溫條件下，回流和不回流體系中優勢古菌均為甲烷鬃毛菌屬，細菌群落結構存在明顯差別，門水平上優勢菌分別為厚壁菌門和綠屈撓菌門，而高溫條件下的微生物群落則非常相似。

本試驗采用實驗室豬糞中溫厭氧消化連續試驗，研究消化液直接回流過程中微生物群落結構組成變化特征，并分析其與產氣性能的關系，為優化規模化養殖場大中型沼氣工程的運行參數、提高產氣效率提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬糞取自天津市西青區某養殖有限公司，取當日產鮮豬糞冷藏于（4±1）℃的冰箱。接種物取自實驗室正常運行的有機負荷（OLR）為 4.0 g·L-1·d-1的豬糞中溫混合厭氧反應器（Continuous Stirred Tank Reactor，CSTR）。底物與接種物的理化指標見表1。

表1 底物和接種物的基本性質Table 1 Characteristics of substrates and inoculum sludge

1.2 試驗裝置

試驗裝置為有機玻璃材質的CSTR反應器，有效容積7 L。反應器頂部安裝攪拌裝置，設有進料口、排氣口，側部設上下兩個取樣口，底部設有出料口，反應器采用雙層結構，恒溫水浴加熱（圖1）。

1.3 試驗設計

圖1 厭氧發酵試驗裝置圖Figure 1 Experimental equipment of anaerobic digestion

厭氧發酵的OLR為4.0 g·L-1·d-1（以VS計），水力停留時間（HRT）為30 d。試驗啟動前，在反應器內裝填4 L接種物，加水至7 L。啟動階段，每天排出約233.3 mL的消化液，定量稱取豬糞加蒸餾水至約233.3 mL，混勻后填充至反應器。運行穩定后，出料的50%替代蒸餾水進入反應器，回流試驗共進行219 d。反應器通過雙層水浴加熱，保持發酵溫度為（35±0.5）℃。試驗采取間歇攪拌方式，每攪拌2 h停10 min，轉數為 50 r·min-1。

每天測量產氣量，每2 d測量氣體中CH4和CO2的百分含量，每3 d取消化液分析pH值、揮發性脂肪酸（VFAs，乙酸、丙酸、丁酸和戊酸）、氨氮等指標。取接種物（S0）、試驗第 68 d（S1，1～68 d，短期回流）和第219 d（S2，69～219 d，長期回流）消化液樣品（重復取樣3次）用于微生物群落分析。

1.4 理化指標分析

產生的沼氣收集于氣袋中，通過濕式氣體流量計測量體積，消化液pH、氨氮濃度采用標準方法測定[8]，CH4和CO2的百分含量及VFAs濃度采用前期試驗[9]的處理及分析方法。

1.5 Miseq高通量測序分析

1.5.1 樣品DNA提取

樣品DNA采用Fast DNAs Spin Kit（Mpbio，美國）試劑盒提取，S0、S1和S2的重復樣品（3個）分別提取DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，通過超微量分光光度計（Nano Drop 2000，Thermo Scientific，Wilmington，美國）測定濃度，然后將提取的DNA混勻。

1.5.2 PCR擴增

細菌擴增引物為341F（5′-CCTACACGACGCTCT TCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和 805R（5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATT CCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′），產甲烷古菌擴增引物為 349F[5′-CCCTACACGACGCTCTTCCG ATCTN（barcode）GYGCASCAGKCGMGAAW-3′]和806R（5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC CAGGACTACVSGGGTATCTAAT-3′）[10]。采用 PCR 儀（C100 Thermal Cycler）對樣品16S rDNA基因進行PCR擴增，擴增反應體系及條件參照文獻[11-12]，對PCR產物進行瓊脂糖電泳，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（Cat：SK8131）對 PCR 產物進行回收，回收產物用Qubit 2.0定量。

1.5.3 Miseq測序

樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司，測序平臺為Miseq 2x300，測序后的DNA序列進行拼接，通過barcode標簽序列區分樣品序列，采用Prinseq（0.20.4）對樣本序列做質量控制，在QIIME中調用Uclust（1.1.579）軟件，設置97%相似性，對有效DNA序列數據進行操作分類單元（OTU）分類，采用RDP軟件比對Silva數據庫進行物種分類，在門、綱、目、科和屬分類水平上統計樣本的物種豐度。采用Mothur軟件計算種群豐富度指數（Chao指數、ACE指數）和群落多樣性指數（Shannon指數和Simpson指數）。

2 結果與討論

2.1 沼氣發酵性能參數

表2為厭氧發酵在短期長期回流下沼氣產率、氨氮濃度、乙酸濃度、pH值等參數的平均值。由表可見，消化液回流的平均VS產氣率由409 mL·g-1升高到477 mL·g-1，氨氮、乙酸的平均濃度和pH值也明顯升高，但沼氣中的CH4百分含量有所降低。

表2 沼氣產率及反應器關鍵指標Table 2 Variations of biogas yield and key factors

2.2 微生物群落多樣性分析

在OTUs（操作分類單位）為97%的相似性水平下，對厭氧消化過程中細菌和古菌微生物群落多樣性進行分析比較（圖2、圖3和表3）。由圖2和圖3可知，盡管細菌和古菌的稀釋曲線未達到平坦狀態，但Shannon指數曲線隨著序列數的增加迅速趨于平坦，表明測序數量能夠反映樣品中絕大多數微生物信息[11]。從圖2稀釋曲線和表3中Chao和ACE指數可知，隨著消化時間的延長，厭氧發酵體系中細菌和古菌群落的豐富度均有所提高，細菌的豐富度增加幅度明顯高于古菌。

表征微生物群落多樣性的Shannon指數變化趨勢與Chao、ACE指數相似，隨著發酵的進行呈升高趨勢，表明細菌群落多樣性增加，群落的復雜程度升高，而古菌的Shannon指數基本沒有變化，表明長期消化液回流對古菌群落的多樣性和復雜程度影響不大。厭氧發酵體系中，微生物群落多樣性越高產沼氣性能越好，雖然S2中產甲烷古菌的多樣性沒有明顯增加，但細菌多樣性提高了16.1%，從而導致了沼氣產率的提升。

Simpson指數體現了優勢物種生物量占群落生物總量的比重，該指數越大表明優勢菌群生物量占總生物量比重越小，反之則優勢菌群生物量占總生物量比重越大[12]。與Shannon指數不同，隨著厭氧發酵的進行細菌的Simpson指數降低，而產甲烷古菌的升高，表明細菌優勢菌群的生物量占總生物量的比例增大，古菌優勢菌群的占比減小。

圖2 細菌和古菌的稀釋曲線Figure 2 Rarefaction curves of bacteria and archaeal communities

圖3 細菌和古菌的Shannon指數曲線Figure 3 Shannon index curves of bacteria and archaeal communities

表3 發酵過程中微生物豐富度和多樣性變化Table 3 Richness and diversity of microbial communities during digestion

綜合各指數可以看出，與產甲烷古菌相比，厭氧發酵體系中的細菌具有更高的微生物種群豐富度和多樣性，與已有研究報道相一致，這主要是由細菌和產甲烷古菌遺傳發育的多樣性差異造成的[13]。

2.3 細菌群落結構變化

不同發酵時期樣品中細菌群落在門、綱和屬的分類水平見圖4。由圖4a可知，細菌主要屬于8個門，其中厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要的優勢菌群，在S0、S1和S2中的相對豐度分別為62.79%、71.66%、81.46%和 19.39%、20.32%、6.74%；其次是變形菌門（Proteobacteria）和無壁菌門（Tenericutes），相對豐度分別為 2.59%、1.84%、3.23%和0.04%、0.11%和1.96%；未分類菌門則為12.75%、3.41%和3.36%。

厚壁菌門是厭氧發酵水解酸化階段最優勢的細菌類群，能夠產生降解復雜有機物的纖維素酶、蛋白酶和各種胞外水解酶，在高濃度氨氮的厭氧消化體系中，很多已知的同型乙酸氧化（SAO）菌屬于該門類微生物[14-15]。Sundberg等[16]的研究結果顯示，在餐廚和屠宰場等廢棄物的中溫混合厭氧發酵中，厚壁菌門的相對豐度達到83%。Li等[14]對我國12個以豬場糞污為原料的厭氧沼氣工程微生物分析結果顯示，厚壁菌門的平均豐度為63.73%，其在5個沼氣工程中占絕對優勢，平均豐度達到78.44%，另外，牛場和豬場廢棄物厭氧消化中，游離氨與厚壁菌門成顯著正相關。試驗中不同階段厚壁菌門均占絕對優勢，而且隨著回流時間的延長其相對豐度逐漸升高，達到81.46%，這可能與體系中氨氮濃度逐漸升高有關。擬桿菌門和變形菌門是污泥水解和產酸的主要菌。試驗中，發酵液長期回流對擬桿菌門細菌影響明顯，相對豐度從初期的20%左右降至219 d時的6.74%，而變形菌門和無壁菌門變化較小。

屬于厚壁菌門（Firmicutes）的梭菌綱（Clostridia）包含數量眾多的微生物，具有降解蛋白、脂肪和碳水化合物等多種物質的功能，同時能夠將乙酸和乳酸轉化為H2和CO2[17-18]。試驗中，梭菌綱在不同時期均占明顯優勢，占比分別為58.62%、65.60%和68.19%（圖4b），相對豐度逐漸升高，表明該種群在水解酸化過程中較其他綱微生物具有更強的競爭力，同時反映出消化液回流的厭氧消化系統中梭菌綱與氫營養型甲烷菌的互養關系占主導，并呈加強趨勢[18]。另一種優勢微生物為擬桿菌綱（Bacteroidia），占比分別為2.45%、4.31%和4.92%。其他主要微生物相對豐度幾乎均呈升高趨勢，但不大于3.88%。

圖4 細菌群落結構變化Figure 4 Variation of bacteria communities structure

圖4c為屬分類水平上細菌群落結構，雖然大量的細菌序列未能分類，但屬水平上的群落結構仍能提供反應器中微生物群落功能的重要信息[18-19]。由圖可知，相對豐度高于1.00%的細菌基本屬于厚壁菌門、梭菌綱，以梭菌屬（Clostridium）為優勢菌屬，相對豐度由S0的35.44%經S1的35.77%升高至S2的39.10%，與日平均產氣率的變化一致，表明日平均產氣率與梭菌屬的豐度呈正相關。第二優勢菌屬為具有纖維素降解能力的Saccharofermentans，相對豐度從11.64%經13.9%下降到5.25%。未分類的細菌在各個階段的相對含量分別為28.57%、27.43%和20.66%，表明還存在較多的細菌尚未被分類，需要更深入的研究和挖掘。

2.4 古菌群落結構變化

圖5為消化液回流不同階段產甲烷古菌在門、綱、目、科和屬水平上的群落結構。由圖5a可知，在S0、S1和S2中，產甲烷菌在門水平上非常單一，廣古菌門（Euryarchaeota）占絕對優勢，其相對豐度分別為94.76%、99.89%和 99.59%，泉古菌門（Crenarchaeota）則只占4.40%、0.08%和0.11%。綱水平上（圖5b）甲烷微菌綱（Methanomicrobia）和甲烷桿菌綱（Methanobacteria）是優勢微生物，但隨消化液回流時間的延長表現出不同的變化規律，甲烷微菌綱由S0的53.35%升高至S1和S2的56.97%和78.09%，而甲烷桿菌綱則由S0的38.34%最終下降至S2的16.78%。

目水平上，各產甲烷菌的相對豐度大小表現為甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）＞甲烷桿菌目（Methanobacteriales）＞甲烷微菌目（Methanomicrobiales），消化過程中，前者處于升高的趨勢，中者下降，后者下降，但變化不大，科水平上的古菌相對豐度變化與目水平一致。有研究表明，不同產甲烷菌對體系中有害物質或環境因子具有不同的抵抗能力，高沼氣產率下，甲烷八疊球菌目（科）占比高于其他古菌[20-22]。試驗中，隨著回流時間的延長，雖然對產甲烷微生物具有毒害作用的氨氮的濃度逐漸升高達到5371 mg·L-1，但沼氣的VS產率達到477 mg·g-1（表2），這與高氨氮濃度下甲烷八疊球菌科的相對豐度較高有關。

圖5 產甲烷古菌群落結構變化Figure 5 Variation of archaeal communities structure

雖然整個發酵過程中產甲烷古菌的多樣性差異較小（表3），但在屬水平上分類的差異卻非常明顯（圖5e），可分為7個屬，其中甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和甲烷球菌屬（Methanosphaera）為優勢菌屬。甲烷八疊球菌屬相對豐度由S0的23.99%依次升高到S1的56.55%和S2的72.28%，而甲烷短桿菌和甲烷球菌屬的相對豐度總體呈降低趨勢，分別由16.34%、21.71%降低至3.70%、12.93%，表明回流體系的產氣率與甲烷八疊球菌屬的相對豐度呈正相關，與甲烷短桿菌屬和甲烷球菌屬呈負相關。其他菌屬還包括甲烷鬃毛菌屬（Methanosaeta）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、熱裸單胞菌屬（Thermogymnomonas）、甲烷螺菌屬（Methanospirillum）。

作為畜禽糞污厭氧發酵中常見的優勢產甲烷菌屬，甲烷八疊球菌屬是已知的唯一能夠利用所有產甲烷途徑的菌屬，很多文獻都將其歸結為乙酸營養型產甲烷菌[23-24]，然而這需要進一步研究。試驗中，隨著發酵時間的延長，甲烷八疊球菌屬的相對豐度升高，而包括甲烷短桿菌屬、甲烷球菌屬和甲烷囊菌屬（Methanoculleus）等在內的氫營養型產甲烷菌的總占比在S0和S1中基本相同（43.10%和43.14%），在S2中則下降至22.54%，表明在回流初期多種微生物對甲烷產生的貢獻相當，隨著回流時間的延長，逐漸以甲烷八疊球菌屬的代謝為主，其主要原因可能是：（1）接種物取自長期運行的豬糞厭氧消化反應器，經過高濃度氨氮的馴化，具有較高的氨氮耐受濃度；（2）甲烷八疊球菌屬對氨氮具有高達7000 mg·L-1的耐受濃度[25]，雖然體系中氨氮濃度達到 5371 mg·L-1，但未對甲烷八疊球菌屬產生抑制。

值得注意的是，同屬乙酸營養型產甲烷菌的甲烷鬃毛菌屬和甲烷八疊球菌屬在本研究中表現迥然不同，甲烷八疊球菌屬占絕對優勢，而甲烷鬃毛菌屬S0時為24.14%，S1和S2時則低于0.05%，主要原因是甲烷鬃毛菌屬對乙酸和氨氮均比甲烷八疊球菌屬敏感[22]。甲烷鬃毛菌屬只能代謝乙酸，能在低至0.3～1.2 mg·L-1的濃度環境中生長，在 93.7～140.6 mg·L-1的濃度范圍內為優勢菌屬，而甲烷八疊球菌屬所需最小乙酸濃度約為 60.1 mg·L-1，在 234.3～468.6 mg·L-1以上時為優勢菌屬[23，25]。試驗中，S1和S2的乙酸濃度分別為 52.5 mg·L-1和 3 397.7 mg·L-1，均不在甲烷鬃毛菌屬的最適乙酸濃度內，但是甲烷八疊球菌屬在S2時期處于適宜的乙酸濃度內，因此甲烷八疊球菌屬表現出更強的競爭力[26]。另外，有機負荷也影響乙酸營養型產甲烷菌。有文獻[27]報道，在低有機負荷下甲烷鬃毛菌屬占優勢，而高有機負荷下甲烷八疊球菌屬占優勢，本試驗 VS 負荷為 4.0 g·L-1·d-1，處在較高水平。

3 結論

（1）在消化液回流過程中，細菌較古菌具有更高的多樣性和豐富度，并且隨著回流時間的延長有所提高，而產甲烷古菌變化不明顯。

（2）消化液回流的不同時期，細菌以厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）為主，梭菌屬（Clostridium）占絕對優勢，古菌以甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）為主，且隨回流時間的延長，優勢更加明顯，這與甲烷八疊球菌屬具有高的氨氮和乙酸耐受濃度有關。

（3）回流過程中，發酵體系的日平均產氣率與梭菌屬和甲烷八疊球菌屬的相對豐度呈正相關，而與甲烷短桿菌屬和甲烷球菌屬呈負相關。

（4）在219 d的發酵周期內，回流導致氨氮和揮發性有機酸濃度升高，產氣效率維持在較高水平，雖未表現出抑制作用，但長期運行應關注氨氮濃度變化對微生物和產氣效率的影響。

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