橘子皮中陳皮甙的提取及性能研究

張 帆,鄭敏燕,郭 穎,魏永生

(咸陽師范學院 化學與化工學院,陜西 咸陽 712000)

橘子皮是蕓香科植物橘(Citrus Reticulate Blanco)及其栽培變種的成熟果皮,俗稱桔子皮。中藥陳皮又名貴老,有很高的藥用價值[1],其氣香,味苦辛,性溫,歸脾、肺經,能理氣健脾,燥濕化痰[2]。陳皮甙是橘子皮中的主要成分之一[3],與陳皮甙共存于橘子皮中的黃酮類化合物有新陳皮甙、柑桔黃甙、橙皮黃素、酸橙黃素等。橘子皮中還有中性內酯類苦味質檸檬素及揮發油等成分。陳皮甙對腸管有興奮作用,能降低毛細血管通透性,有健胃、止瀉、祛痰、驅風、鎮嘔等藥理活性[4],也是羥基自由基(·OH)和超氧自由基等對人體有害的自由基的清除劑[5],可以延緩衰老。陳皮可應用于食品、藥品、保健品、精細化工品等行業[6]。

目前,關于從橘子皮中提取陳皮甙的方法的研究較多,主要有堿液提取法、熱水提取法、醇提法、索氏提取法、微波輔助提取法、超聲波強化提取法、超臨界CO2萃取法等[7-8]。最經濟實用的提取方法一般是超聲波輔助乙醇提法,設備易得,溶劑可回收再用,提取條件溫和,提取率較高。本研究以干橘子皮為原料提取陳皮甙,用超聲波輔助乙醇提法確定陳皮甙的最佳提取工藝條件,并測試陳皮甙的抗氧化活性,為橘子皮資源的開發利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

儀器:UV-6300PC型紫外可見分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;FA214電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;RE-2000E旋轉蒸發器,上海科升儀器有限公司;SB-4200DTD超聲波清洗機,寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-系列恒溫水浴鍋,河北省黃駿市渤海電器廠;DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱,上海祁欣科學儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵,鄭州長城科工貿有限公司;抽濾瓶、布氏漏斗、索式提取器及玻璃儀器,天津市化玻儀器有限公司。

試劑:陳皮甙對照品，購置于中國藥品生物制品檢驗所;95%乙醇、甲醇、乙醚、硝酸鋁、濃鹽酸、鎂粉、鄰二氮菲、過氧化氫、硫酸亞鐵、三氯化鋁、磷酸等,均為分析純,西安化學試劑廠。0.75 mmol鄰二氮菲溶液、0.75 mmol硫酸亞鐵溶液、pH=7.4的磷酸緩沖溶液,臨時配制。

材料:橘子皮，于2015年11月上旬收集于陜西南部的秦巴山區,經過鑒定,確認是成熟橘子的外皮。將橘子皮置于烘箱中,保持50 ℃烘干,粉碎后過200目篩,密封備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 橘子皮中陳皮甙提取率的確定

準確稱取陳皮甙對照品0.3750 mg,用乙醇定容,分別配置成0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 mg/mL的陳皮甙對照品溶液,取4支10 mL的具塞試管，均加入陳皮甙對照品溶液4 mL,再分別加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液,置于80 ℃的水浴鍋中反應15 min,并定容至10 mL,在最大波長420 nm處用乙醇溶液作為參比,測定其吸光度,平行次數3次,取平均值。可得標準回歸曲線方程為:y=23.200x+0.0166,R2=0.9999,其中，x指標準品的濃度(mg/mL),y為吸光度。稱取1.000 g橘子皮粉末,放入小型索氏提取器的濾紙桶里,用乙醚回流提取至無色，以除去脂溶性物質,回收乙醚[9]。將橘子皮粉末取出,晾干后放入塑料提取管,以乙醇溶液為提取溶劑,用超聲波輔助提取技術在不同的固液比、乙醇濃度、提取時間和提取溫度等條件下提取橘子皮中的陳皮甙,抽濾,將橘子皮粉末用同樣方法再提取一次,將濾液一起轉移到100 mL容量瓶中,洗滌,用乙醇溶液定容。取待測樣品4 mL放入10 mL具塞試管,加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液,置于80 ℃的水浴鍋中反應15 min,并定容至10 mL,測定樣品時,以硝酸鋁試劑作為空白，在420 nm處測定其吸光度,根據標準曲線回歸線方程確定陳皮甙的提取率。

1.2.2 陳皮甙提取工藝條件的優化

采取超聲波輔助提取法,在超聲波功率為400 W、工作頻率為40 KHz條件下考察固液比、乙醇濃度、提取時間和提取溫度等因素對陳皮甙提取率的影響。實驗中,固液比為1∶5、1∶9、1∶13、1∶17、1∶21(g/mL);乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%;提取溫度為50、60、70、80、90 ℃；提取時間為5、15、25、35、45 min。在單因素實驗基礎上,設計四因素三水平L9(34)正交試驗進行優化,以確定超聲波輔助下陳皮甙提取的最佳工藝條件。

1.2.3 陳皮甙的定性檢測

在最佳工藝條件下提取陳皮甙,用10 mL甲醇將陳皮甙配成質量百分比濃度為2%的陳皮甙甲醇溶液。通過陳皮甙與金屬離子的顏色反應、還原性反應定性檢測從橘子皮中提取的陳皮甙。與金屬離子反應:取陳皮甙少許置于試管中,加甲醇2 mL,在水浴中加熱溶解;加1%三氯化鋁試劑2～3滴,顏色呈鮮黃色。還原性反應:取陳皮甙少許置于試管中,加乙醇2 mL,在水浴中加熱溶解,然后向其中加入鎂粉約50 mg,振搖后,滴加濃鹽酸3～4滴,產生劇烈反應,溶液逐漸由淺黃色變為紅色。

1.2.4 陳皮甙對羥基自由基清除率的測定

用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定Fe2+/H2O2體系中的·OH清除率。配制50 mL濃度為0.30 mg/mL的陳皮甙水溶液,取6支25.0 mL已編號的容量瓶,在每支瓶中加入1.0 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液及0.2 mol/L(pH=7.4)的PBS緩沖溶液1.5 mL,混合均勻后再加入1.0 mL新配置的0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液,然后向1～6號容量瓶中分別加入2、4、6、8、10、12 mL的陳皮甙水溶液,搖勻后,再向每支容量瓶中加入新配制的0.01%過氧化氫各1 mL。另取2支25.0 mL的容量瓶并分別標記為損傷管、未損傷管,在損傷管中加入0.01%的過氧化氫1 mL,未損傷管中不加過氧化氫。然后,用蒸餾水將8支容量瓶定容至刻度線,充分搖勻,在37 ℃的生化培養箱中培養1 h后取出,冷卻至室溫,在波長為510 nm下測量樣品的吸光度A,平行測三次,取平均值。對·OH清除率計算公式為:I(%)=(A2-A0)/(A1-A0)×100%。其中,A2為陳皮甙水溶液的吸光度，A1為未損傷溶液的吸光度，A0為損傷溶液的吸光度。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 固液比對陳皮甙提取率的影響

實驗條件如下：提取溫度為80 ℃,乙醇濃度為80%,固液比分別為1∶5、1∶9、1∶13、1∶17、1∶21,在超聲波清洗機中提取35 min。固液比對陳皮甙提取率的影響如圖1所示。在溫度和乙醇濃度一定的條件下,當固液比為1∶17時,橘子皮中陳皮甙的提取率最高。溶劑過少或過多都會影響陳皮甙的提取率:溶劑過少,溶解不充分,不利于陳皮甙分子擴散;溶劑過多,耗損能量,使超聲波對陳皮甙分子的作用力減小。因此,選定固液比為1∶17。

圖1 固液比對提取率的影響

2.1.2 乙醇濃度對陳皮甙提取率的影響

提取溫度為80 ℃,固液比為1∶17,乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%,在超聲波清洗機中提取35 min。乙醇濃度對陳皮甙提取率的影響如圖2所示。在溫度、固液比、時間一定的條件下,乙醇濃度為80%時,橘子皮中陳皮甙的提取率最高,可達6.11%;當乙醇濃度高于80%時,陳皮甙的提取率明顯下降。可見，乙醇濃度對提取率有較大影響。乙醇濃度過高時會抑制陳皮甙分子溶出,這與陳皮甙分子的糖體不易溶于高濃度乙醇溶液的結果相一致。因此,確定乙醇濃度為80%。

圖2 乙醇濃度對提取率的影響

2.1.3 溫度對浸提效果的影響

固液比為1∶17、乙醇濃度為80%,溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，在超聲波清洗機中提取35 min。提取溫度對陳皮甙提取率的影響如圖3所示。當溫度為80 ℃時,橘子皮中陳皮甙的提取率最高,為6.09%。提取溫度過低不利于陳皮甙的析出；陳皮甙的提取率隨著溫度的升高而升高；當溫度超過80 ℃時，提取率開始下降,提取液在較高溫度時在超聲波輔助下會使陳皮甙降解。應選擇在乙醇溶液微沸的狀態下從橘子皮中提取陳皮甙,確定提取溫度為80 ℃。

圖3 提取溫度對提取率的影響

2.1.4 提取時間對浸提效果的影響

固液比為1∶17、乙醇濃度為80%、提取溫度為80 ℃，提取時間分別為5、15、25、35、45 min,在超聲波清洗機中提取陳皮甙。提取時間對陳皮甙提取率的影響如圖4所示。在5～35 min時,陳皮甙的提取率持續遞增;陳皮甙的提取率在35 min后開始下降;較長時間的超聲波處理和持續的加熱會使陳皮甙中的部分糖甙鍵斷裂,使其提取率降低。選定提取時間為35 min。

圖4 提取時間對提取率的影響

2.2 正交試驗

在固液比、提取液濃度、提取溫度及提取時間等單因素實驗結果的基礎上,依據各因素的選取范圍,設計四因素三水平L9(34)正交試驗表進行研究,以優化和確定陳皮甙的最佳提取工藝條件。因素水平見表1,正交試驗結果如表2所示。

表1 試驗因素水平

表2 正交試驗結果

續表:

由表2可知,影響陳皮甙提取率的主次因素為:乙醇濃度>固液比>提取溫度>提取時間。最佳工藝條件為:超聲波功率400 W,工作頻率40 KHz,固液比1∶17,乙醇濃度80%,溫度80 ℃，提取時間35 min。在該工藝條件下進行驗證,實驗平行3次,取平均值,得到陳皮甙的提取率為6.60%。驗證實驗結果與正交試驗結果基本一致,說明該提取工藝有可行性,重現性好,陳皮甙的提取率穩定,適合中小企業批量生產。

2.3 陳皮甙的顯色

從橘子皮中提取的陳皮甙經定性檢驗,其顯色實驗結果對比如圖5所示。從左至右,第一個試管中是未加濃鹽酸和鎂粉的陳皮甙乙醇溶液,溶液呈淺黃色;第二個試管是第一個試管的對照品,其中是加入濃鹽酸和鎂粉的陳皮甙乙醇溶液,溶液由淺黃色變為紅色。第三個試管中是未加三氯化鋁的陳皮甙甲醇溶液,溶液呈淺黃色;第四個試管是第三個試管的對照品,里面是加了三氯化鋁的陳皮甙甲醇溶液,溶液由淺黃色變為鮮黃色,說明從橘子皮中可以提取陳皮甙。

圖5 陳皮甙的顯色實驗

2.4 陳皮甙對·OH的清除作用

陳皮甙對·OH的清除實驗結果如圖6所示。隨著陳皮甙水溶液濃度的增大,陳皮甙對·OH的清除率呈現增高趨勢,陳皮甙的用量與·OH的清除率之間存在量效關系,陳皮甙對·OH有很好的清除作用。實驗平行進行3次,由圖6中的曲線可以看出陳皮甙對·OH的清除作用明顯且穩定。隨著陳皮甙濃度的增大,對·OH的清除率不斷提高,說明陳皮甙具有抗氧化活性。

圖6 陳皮甙對·OH的清除作用

3 結論

在功率400 W、工作頻率40 KHz的超聲波輔助作用下,考察固液比、乙醇濃度、提取時間和提取溫度等單因素對陳皮甙提取率的影響。通過四因素三水平正交試驗確定從橘子皮中提取陳皮甙的最佳工藝提取條件為:固液比1∶17(g/mL),乙醇濃度80%,提取溫度80 ℃,提取時間35 min。在該工藝條件下,陳皮甙的提取率可達6.6%。此工藝可為中小企業規模化生產提供前期的技術支撐。從橘子皮中提取陳皮甙進行定性檢驗,結果說明可從橘子皮中提取陳皮甙。通過Fe2+/H2O2體系測試陳皮甙清除·OH的效果,結果顯示陳皮甙對·OH有明顯的清除作用,且陳皮甙的用量與·OH的清除率之間存在量效關系,這為陳皮甙的應用提供了參考。本研究僅初步從橘子皮中提取陳皮甙,并對陳皮甙清除·OH的效果進行測試,關于陳皮甙的其他生物活性及其構效關系有待深入研究。

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