超聲波法提取香菇粗多糖的提取條件研究

張君　王波　王冬妍

摘要：本文以市售香菇為原料，蒸餾水為提取溶劑，采用超聲波法提取香菇粗多糖。首先對(duì)料液比、超聲波功率、超聲時(shí)間這三個(gè)因素對(duì)香菇粗多糖提取率的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后采用正交試驗(yàn)確定香菇粗多糖最佳提取條件。最佳提取條件為：料液比為1：80（克/毫升），超聲波功率為160瓦，超聲時(shí)間為2小時(shí)。在上述條件下香菇粗多糖提取率為16.7%。

關(guān)鍵詞：超聲波法；香菇；粗多糖

香菇粗多糖是一種特殊的免疫調(diào)節(jié)劑，能夠清除氧自由基，延緩衰老，在抗癌防癌方面有著重大的作用。目前香菇粗多糖多做成膠囊作為藥品出售，比如健立欣牌香菇粗多糖膠囊，可以作為乙肝和消化道腫瘤的輔助藥物。在生態(tài)農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用也越來越多，香菇粗多糖抗病毒劑現(xiàn)在已經(jīng)被用于有機(jī)蔬菜農(nóng)藥的病毒防治中。

眾所周知，香菇是一種藥食兩用菌，它含有豐富的香菇粗多糖、香菇嘌呤、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分。經(jīng)常食用香菇或者香菇制品，可以降低血液中膽固醇含量，降低高血壓患病的風(fēng)險(xiǎn)，還具有減肥美容等功效。

由于人們對(duì)于健康的關(guān)注度越來越高，對(duì)于香菇粗多糖的提取條件研究也日漸增多，張昌軍和邵紅兵等人就研究過超聲波法在提取粗多糖物質(zhì)。酸提法、堿提法和熱水浸提法這些是傳統(tǒng)的香菇粗多糖提取方法，在本試驗(yàn)中，采用的是超聲波法提取香菇粗多糖。超聲波法不僅提取時(shí)間短，而且耗能低，還節(jié)約了大量溶劑，大大提高了提取效率。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

市售鮮香菇。

1.2儀器設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AL204-IC電子天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DHG9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；TD5Z臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南省凱達(dá)實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；FW100萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法及設(shè)計(jì)

1.3.1香菇粗多糖的超聲波法提取工藝流程香菇→干燥→過篩→配制溶液→超聲波浸提→離心→過濾→定容→稀釋→測(cè)定吸光度→計(jì)算粗多糖提取率。

1.3.2操作要點(diǎn)

（1）原料預(yù)處理

將超市買來的鮮香菇先用清水沖洗干凈，去除木屑等雜質(zhì)成分，用菜刀切成1厘米的方塊大小，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)80℃烘干5小時(shí)至恒重。然后放置于粉碎機(jī)中粉碎兩遍后過80目篩，得到香菇干粉。

（2）離心

將超聲波法浸提得到的粗多糖溶液放入離心管內(nèi)，分別標(biāo)上號(hào)，在4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上層清液。

（3）定容

把濾液和洗滌液一起倒入100毫升容量瓶中，蒸餾水定容到100毫升。

1.3.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）料液比的選擇

用天平精確稱量香菇粉0.500克，蒸餾水為提取溶劑，按照料液比為1：20（克/毫升），1：30（克/毫升），1：40（克/毫升），1：50（克/毫升），1：60（克/毫升）分別加入5個(gè)試管中，試管分別放入超聲波清洗機(jī)中，設(shè)定超聲時(shí)間30分鐘，超聲波功率200瓦，超聲波提取溫度35℃，處理過的香菇溶液倒入離心管中，在4000轉(zhuǎn)/分速度下離心10分鐘，用濾紙進(jìn)行過濾得到A液，將A液用蒸餾水定容至100毫升，得到B液，再取1毫升B液稀釋40倍，用苯酚硫酸法測(cè)粗多糖含量，選擇最佳料液比。

（2）超聲時(shí)間的選擇

用天平精確稱量香菇粉0.500克，蒸餾水為提取溶劑，料液比上一步所確定的值，超聲波功率200瓦，超聲波提取溫度35℃，分別在超聲時(shí)間為0.5、1、2、3、4小時(shí)的條件下進(jìn)行處理，處理后將溶液倒入離心管中，在4000轉(zhuǎn)/分的離心速度下離心10分鐘后，用濾紙進(jìn)行過濾后得到A液，將A液用蒸餾水定容至100毫升，得到B液，再取1毫升B液稀釋40倍，最后用苯酚硫酸法測(cè)粗多糖含量，選擇最佳超聲時(shí)間。

（3）超聲波功率的選擇

用天平精確稱量0.500克香菇粉，蒸餾水為提取溶劑，料液比為第一步確定的值，超聲時(shí)間為第二步確定的值，超聲波提取溫度35℃，分別在超聲波功率為40瓦，80瓦，120瓦，160瓦，200瓦的條件下進(jìn)行處理，處理后樣品倒入離心管中，在4000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)中離心10分鐘，用濾紙進(jìn)行過濾得到A液，將A液用蒸餾水定容至100毫升得到B液，再取1毫升B液稀釋40倍，用苯酚硫酸法測(cè)粗多糖含量，選擇最佳超聲波功率。

1.3.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，3個(gè)因素是料液比、超聲時(shí)間和超聲波功率，再分別選取對(duì)應(yīng)的3個(gè)水平，采用L9（34）正交表來設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得到香菇粗多糖提取率，根據(jù)粗多糖提取率大小，最后確定多糖提取最佳條件。

1.3.5香菇粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確稱量5.000克葡萄糖，在105℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘至恒重，得到標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖，然后精確稱量標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖1.000克，放入100毫升容量瓶中，加蒸餾水定容到100毫升得到1克/100毫升儲(chǔ)備液。再取1毫升的儲(chǔ)備液加入100毫升容量瓶中，加蒸餾水定容到100毫升，得到0.1毫克/毫升的工作液。5%的苯酚溶液配制：用燒杯稱量苯酚5.000克，向燒杯中加入20毫升蒸餾水，在石棉網(wǎng)上加熱燒杯，用玻璃棒不斷攪拌，直至苯酚全部溶解于蒸餾水中，把燒杯中液體倒入100毫升容量瓶中，用蒸餾水沖洗燒杯1～2次并定容至100毫升。先取7支試管標(biāo)上號(hào)，如表1所示。首先向試管中分別加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，其次用吸量管吸取蒸餾水補(bǔ)至2毫升刻度線，混合均勻，再用1毫升的吸量管吸取5%的苯酚溶液1毫升分別加入到試管中，振蕩兩三次后，再用5毫升的吸量管吸取濃硫酸5毫升倒入試管內(nèi)，振蕩后，先把試管放在沸水浴中加熱10分，加快反應(yīng)的進(jìn)行速度，再放在冰水混合物的水浴里冷卻5分，停止反應(yīng)，有利于比色進(jìn)行。用蒸餾水做空白對(duì)照，于紫外490納米處測(cè)定吸光值。

1.3.6香菇粗多糖含量的測(cè)定 香菇粗多糖的含量測(cè)定采用苯酚硫酸法。首先準(zhǔn)確吸取1毫升定容后的粗多糖溶液倒入燒杯中，再向燒杯中加入39毫升的水，稀釋40n，得到粗多糖工作液。取2毫升多糖工作液加入試管中，向其中加入1毫升5%苯酚，振蕩，再加入濃硫酸5.0毫升，搖勻，先置于沸水浴中加熱10分，再置于冰水浴中冷卻5分，最后在紫外490納米處測(cè)吸光值，用2毫升蒸餾水進(jìn)行同樣的顯色操作為空白對(duì)照組，此時(shí)吸光值設(shè)為0。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線建立回歸方程，計(jì)算粗多糖含量。

1.3.7香菇粗多糖提取率計(jì)算

式中：c為香菇粗多糖的含量（毫克/毫升）；m為香菇粉質(zhì)量（毫克）；n為稀釋倍數(shù)；v為粗多糖提取液的體積（毫升）。

2結(jié)果與分析

2.1回歸曲線的繪制

根據(jù)表1所得到的數(shù)據(jù)結(jié)果，做吸光值關(guān)于葡萄糖濃度的曲線，如圖1所示。

由圖1分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=8.0286x+0.00914，其中，R2=0.99873，x為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度，y為吸光值。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1料液比對(duì)香菇粗多糖提取率的影響 精確稱取0.5000克香菇粉，設(shè)定超聲時(shí)間30分，超聲波功率200瓦，分別在料液比為1：20（克/毫升），1：30（克/毫升），1：40（克/毫升），1：50（克/毫升），1：60（克/毫升）的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，超聲波溫度35℃，離心速度4000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間10分，研究料液比對(duì)香菇粗多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著溶劑量增加，香菇粗多糖提取率也隨之增大，當(dāng)料液比為1：20（克/毫升）、1：30（克/毫升）、1：40（克/毫升）、1：50（克/毫升）和1：60（克/毫升）時(shí)，粗多糖提取率分別為1.93%、3.12%、8.04%、8.94%、14.69%。因此料液比選擇1：60（克/毫升）最佳，主要是由于蒸餾水與香菇粉的接觸面積太小，粗多糖不能完全溶解。隨著溶劑量增加，香菇粉與蒸餾水接觸的面積變大，粗多糖分子流出量會(huì)增多，因此，粗多糖提取率增大。料液比選擇1：60（克/毫升）最佳，此時(shí)粗多糖提取率最大，為14.69%。

2.2.2超聲時(shí)間對(duì)香菇粗多糖提取率的影響 精確稱取0.5000克香菇粉，在超聲波功率200瓦，料液比1：60，超聲時(shí)間分別為30分、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)的條件下進(jìn)行5組試驗(yàn)，其他工藝條件保持不變，研究超聲時(shí)間對(duì)香菇粗多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出：當(dāng)超聲時(shí)間為30分、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)時(shí)，粗多糖提取率分別為11.27%、12.26%、7.95%、7.05%、6.82%。當(dāng)超聲時(shí)間處于30分和1小時(shí)之間時(shí)，粗多糖提取率快速升高，當(dāng)超聲時(shí)間在1～4小時(shí)之間時(shí)，粗多糖提取率緩慢降低。隨著超聲時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，香菇粗多糖分子會(huì)從細(xì)胞壁中流出至溶液中，提取率會(huì)增大；超聲處理時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)破壞多糖分子間化學(xué)鍵，令粗多糖提取率下降。可知在超聲時(shí)間為1h，此條件下香菇粗多糖提取率最高，為12.26%。

2.2.3超聲波功率對(duì)香菇粗多糖提取率的影響 精確稱取0.5000克香菇粉，提取條件為料液比1：60（克/毫升），超聲時(shí)間1小時(shí)，超聲波功率分別為40瓦、80瓦、120瓦、160瓦和200瓦，由于使用的超聲波清洗機(jī)最高功率為200瓦，即在20%、40%、60%、80%和100%功率條件進(jìn)行試驗(yàn)，其他工藝條件保持不變，研究超聲波功率對(duì)香菇粗多糖提取率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，當(dāng)超聲波功率處于40瓦，80瓦，120瓦，160瓦和200瓦時(shí)，多糖提取率分別為3.21%、5.17%、8.62%、10.33%、7.84%。當(dāng)超聲波功率介于40瓦到160瓦之間時(shí)，超聲波功率增大，粗多糖提取率也增大。超聲波能在幾秒鐘產(chǎn)生幾千帕壓力是由于超聲波自身強(qiáng)大的空化作用，破壞香菇粗多糖細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)，使香菇粗多糖溶出速度加快；當(dāng)超聲波功率在160-200瓦之間時(shí)，隨著超聲波功率的增大，粗多糖提取率減小，由于超聲功率變大，粗多糖提取液中分子熱運(yùn)動(dòng)加快，粗多糖分子在溶液中的滯留時(shí)間大大縮短，減輕了損壞細(xì)胞壁能力；另一方面，過高的超聲波功率會(huì)令糖苷鍵破壞，使粗多糖分解，降低了粗多糖提取率。在超聲波功率處于160瓦時(shí)，粗多糖提取率最大，為10.33%。

2.5正交試驗(yàn)

2.3.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用L9（33）的正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素1-3水平：A分別是1：40，1：60，1：80，B分別是30分、1小時(shí)、2小時(shí)；C分別是120瓦、160瓦、200瓦，正交試驗(yàn)因素水平見表2。

2.3.3工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 為了驗(yàn)證最佳提取條件是否正確，按照上述得到的最佳提取條件，即在料液比為1：80（克/毫升），超聲時(shí)間為2小時(shí)，超聲波功率為160瓦的條件下進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果得到粗多糖提取率平均值為16.7%，這次試驗(yàn)得到的粗多糖提取率超過了正交試驗(yàn)的測(cè)定值，所以選擇的工藝條件是科學(xué)的。

3結(jié)論

超聲波功率是影響香菇粗多糖提取率的主要因素，料液比和超聲時(shí)間是影響香菇粗多糖提取率的次要因素。超聲波法提取香菇粗多糖結(jié)果顯示：在料液比1：80（克/毫升），超聲時(shí)間2小時(shí)，超聲波功率160瓦的條件下，香菇粗多糖提取率最高，為16.7%。