大豆疫霉細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶的生物信息分析

張 蕾， 艾 嘉， 韓毅強， 王彥杰， 晏 磊， 高亞梅， 王偉東

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶 163319)

卵菌是色菌界(Chromista)中一類二倍體真核微生物，包括許多重要的植物病原菌[1]。卵菌的寄主范圍很廣，其中包括蔬菜、果樹、中藥材、花卉、棉、麻、油料等重要經濟作物。由卵菌引起的植物病害大多難以控制，尤其是霜霉菌(霜霉病)和疫霉菌(疫病)潛伏期短，再侵染次數多，常暴發流行而導致損失嚴重[2]。卵菌在進化上與真菌相差很遠，進化上的差異使得疫霉菌擁有一套與其他真菌不同的致病機制，多數殺菌劑對植物疫病無效。大豆疫霉屬(Phytophthorasojae)屬于卵菌門的疫霉菌屬，是大豆根腐病的主要病原菌之一，能在任何一個時間點使大豆染病，包括大豆的種子發育期。盡管包括大豆疫霉在內已有多個疫霉菌完成了基因組測序，但疫霉菌遺傳轉化困難，對疫霉菌與植物互作以及致病機理、基因功能等的研究進展緩慢[3]。

細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)，是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，其ATP 結合口袋位于較短的 N 端(β片層) 和較長的 C端(α-螺旋)之間的“葉狀” 深裂，調控ATP或底物與細胞周期蛋白依賴性激酶的特異性結合[4]。細胞周期蛋白(cyclin)屬于細胞周期的正調控蛋白，具有組織特異性和種屬特異性[5]。CDK與細胞周期蛋白以非共價鍵結合形成復合物，并通過調節細胞周期蛋白的表達和降解，參與酶的調節并維持細胞周期有序進行，其中CDK為催化亞基，細胞周期蛋白為調控亞基。不同的細胞周期蛋白-CDK復合物具有不同的生物學功能，并通過CDK的底物磷酸化，實現對細胞周期不同時期的推進和轉化[6-7]。完整的細胞周期過程受多種蛋白酶的調控，在動物細胞中，調控失調則會導致細胞過度增殖引發腫瘤，而通過抑制CDK的活性則可以抑制細胞的增殖[8]。目前，已經篩選到了很多CDK的抑制劑。在酵母的研究中發現，勃利霉素可以抑制Cdc28[9]。大豆疫霉同樣受勃利霉素的強烈抑制，但勃利霉素是否影響其CDK蛋白還不清楚。

本研究利用生物信息學方法對大豆疫霉細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶進行分析，為大豆疫霉細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶更加深入的功能研究及其抑制劑的篩選提供基礎。

1 材料與方法

1.1 大豆疫霉基因組內CDK蛋白搜索

利用CDK蛋白的保守結構域在大豆疫霉基因組數據Joint Genome InstitutePhytophthorasojaedatabase v.1.1進行序列比對分析，篩選獲得大豆疫霉基因組包含的CDK蛋白，在蛋白激酶數據庫kinase.com利用BLAST程序分析確定其所屬類型，對其進行分類。

1.2 大豆疫霉psCdc2與酵母Cdc28同源性分析

所有預測到的細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶與酵母的細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶Cdc28蛋白質序列的氨基酸序列用MEGA[10]進行系統進化樹的構建，建樹方法采用鄰接法(neighbor-joining method)。系統進化關系的穩健性通過 1 000 次自舉法檢驗。將蛋白序列提交到CDD[11]進行保守區域預測，并預測其功能活性位點。將與酵母Cdc28高度同源的基因的轉錄序列提交到疫霉數據庫的BLAST程序，數據庫選擇為SANGER EST，搜索EST序列。

1.3 大豆疫霉細胞周期依賴性蛋白激酶psCdc2的生物信息分析

在Expasy網站(www.expasy.org)利用ProtParam分析大豆疫霉細胞周期依賴性蛋白激酶psCdc2蛋白的基本特征，提交序列后，參數默認進行分析。利用ProtScale 程序分析蛋白質的親疏水性，參數默認。利用Signal P程序[12]分析該蛋白是否含有信號肽，在organism group選項中選擇真核生物，其他參數默認。利用TMHMM[13](http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜結構預測；利用ProtComp[14](http：//www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan & group=programs&subgroup=proloc)進行亞細胞定位預測；利用GOR4[15](https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預測該蛋白的二級結構。利用Expasy 提供的SWISSMODEL軟件對該蛋白的三維結構進行了模擬，選擇自動模擬。在STRING數據庫[16]利用酵母Cdc28蛋白進行搜索獲得相互作用蛋白，在NCBI數據庫獲得其對應的核酸序列，利用NCBI的BLASTN在大豆疫霉基因組內進行相似性搜索，獲得對應的同源蛋白。

2 結果與分析

2.1 大豆疫霉基因組內的細胞周期依賴性蛋白激酶

在大豆疫霉基因組共發現11個CDK家族蛋白，在蛋白激酶數據庫對其進行分類，將其歸為CDC2、CDC7、CDC8、CRK7等(表1)，對CDK蛋白保守序列分析表明其均為蛋白激酶超家族(PKc-like superfamily)。

表1 大豆疫霉基因組內CDK家族蛋白

2.2 大豆疫霉的細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶Cdc28/Cln2同源基因

大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)與酵母Cdc28高度同源，兩者蛋白質序列的一致性百分比為66%，相似性百分比為80%，在進化樹的同一分支(圖1)。大豆疫霉基因組數據庫對其進行了初步注釋，初級轉錄物長度1 153 bp，編碼區CDS為930 bp，多肽鏈為309個氨基酸，基因包含1個內含子。

利用保守結構域分析大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)表明其包含特異性的細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶的結構域(圖2)，與酵母Cdc28蛋白的保守結構域高度相似。其主要的結構域是STKc_CDK1_like，它包括其完成功能的活性位點：ATP結合位點17個，分別為V(10)G(11)E(12)G(13)A(31)K(33)V(65)F(81)E(82)F(83)V(84)D(87)R(90)Q(131)N(132) L(134)D(145)；底物結合位點27個，分別為I(11)G(12)E(13)G(14)V(19)A(32)K(34)R(51)V(65) F(81)E(82)F(83)V(84)D(87)K(129)Q(131)N(132)L(134)D(145)L(148)T(160)E(162)V(163)T(165)W(167)G(205)D(206)?；钚原h(A-loop)包含24個氨基酸，位于144～167之間，氨基酸序列為GDFGLAREYGVPLRR YTHEVVTLW；CDK/cyclin相互作用界面包括12個氨基酸，分別為L(36)E(41)G(42)I(43) S(45)M(48)R(49)I(51)S(52)K(55)E(56)Y(74)。該結構域在數據庫中的注釋為細胞周期蛋白依賴性蛋白1-類似的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinases，STKs)催化結構域。絲氨酸/蘇氨酸激酶催化ATP的γ-磷酸基團轉移到蛋白質的絲氨酸/蘇氨酸殘基。依據上述對大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_35201)序列的詳細分析，認為其為酵母Cdc28的同源基因，具有相似的細胞周期調控的功能(圖3)。在蛋白激酶數據庫確定其為CMGC/CDK/CDC2C，與CDK2_Hsa相似性為82%，一致性百分比為66%，E值為10-114。

2.3 大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)蛋白基本特征分析

對大豆疫霉細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶psCdc2蛋白的基本特征進行分析。該蛋白由20種氨基酸組成，其中亮氨酸與纈氨酸含量最高，不含有吡咯賴氨酸(Pyl)與硒半胱氨酸(Sec)。使用TMHMM工具進行跨膜結構分析，結果表明該蛋白不存在跨膜結構域。使用ProtComp分析工具進行細胞內定位分析，結果顯示該蛋白都主要分布在細胞質與細胞核內。ProtParam分析結果顯示，該蛋白分子量為35 478 u，等電點為8.56。該蛋白在大腸桿菌體內的半衰期大于10 h，酵母體內的半衰期大于20 h，屬于穩定存在蛋白。蛋白的脂肪族系數為92.72，ProtScale程序的親疏水性分析表明其親水性略強(圖4)。信號肽分析程序Signal P分析結果顯示，該蛋白質無信號肽(圖5)。

利用二級結構預測軟件GOR4預測該蛋白的二級結構組成。該蛋白的二級結構組件為α螺旋占32%，β折疊占15%，無規則卷曲為53%，二級結構預測結果見圖6-A。預測的三維結構見圖6-B，其為單體結構，屬于α/β型蛋白。

在STRING 數據庫中利用酵母Cdc28基因進行分析，共發現有10個蛋白與Cdc28基因存在相互作用，形成復雜的互作網絡(圖7)。

利用BLAST在大豆疫霉基因組內對這些同源基因進行搜索，找到了全部的10個同源蛋白(表2)， 蛋白的一致性百分比在26%～46%，說明在大豆疫霉基因組內可能同樣存在它們之間的相互作用網絡，共同調節細胞周期過程。

3 結論與討論

細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶是細胞周期順利進行的催化劑，很多研究表明細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶家族是高度復雜的[17-19]。細胞周期的形成過程中，需要通過精密調控姐妹染色體的分離、紡錘體的形成以及細胞骨架構建，從而達到在時間和空間上高度協調一致，使得整個進程順利進行。目前已經在致病疫霉中發現，在游動孢子囊的形成起著重要調控作用的PiCdc14基因，在菌絲生長階段并不轉錄，只在游動孢子囊形成階段特異地轉錄[20]。在大豆疫霉基因組中找到了它的同源基因PsCdc14基因，該基因在游動孢子囊形成的過程中發揮著同樣的作用[21]。該基因與致病疫霉中的PiCdc14基因具有相似的轉錄模式，在游動孢子囊產生階段、游動孢子階段和休止孢階段上調表達。在本研究中通過對大豆疫霉基因組進行分析，共發現了大豆疫霉中有11個CDK家族蛋白，對其中大豆疫霉psCdc2基因進行研究與功能預測，為后續研究奠定基礎。

在酵母研究中發現，酵母細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶Cdc28/Cln2的有效抑制劑勃利霉素，可以抑制酵母的細胞周期，導致細胞停留在G1期，不能進行RNA和蛋白質的生物合成，不能夠進入下一階段S期[9，22]。勃利霉素在酵母中通過蘇氨酰tRNA合成酶和細胞周期調節蛋白2條途徑發揮作用。目前的研究發現，在大豆疫霉中勃利霉素也能通過蘇氨酰tRNA合成酶途徑發揮作用[22-23]，在對大豆疫霉psCdc2與酵母Cdc28進行比對時發現，兩者高度同源，在進化樹的同一分支，且兩者蛋白的保守結構域高度相似，確定了大豆疫霉psCdc2中的細胞周期蛋白依賴性蛋白1-類似的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinases，STKs)催化結構域的主要結構域STKc_CDK1_like，說明其具有與酵母相似的調控細胞周期的功能。對酵母Cdc28基因分析中，共發現有10個蛋白與Cdc28基因存在相互作用，并在大豆疫霉基因組找到其全部同源蛋白。由此推測勃利霉素對疫霉的細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶也存在抑制作用，為勃利霉素抗卵菌的多途徑作用機理研究提供依據與參考。

表2 大豆疫霉基因組內與酵母Cdc28基因相互作用蛋白的同源蛋白

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