解淀粉芽孢桿菌HAB-6抑菌物質及其相關基因的分析

王皓楠， 靳鵬飛， 康 迅， 謝清標， 劉文波， 鄭服叢， 繆衛國

(海南大學環境與植物保護學院，海南海口 570228)

芽孢桿菌在生長過程中能夠產生不同的抑菌物質，已報道的脂肽類物質是芽孢桿菌作為生防菌產生的最主要的抑菌物質，尤其是其可以產生具有極高生物工程利用價值的脂肽類和肽類抗生素[1-2]，如非核糖體途徑合成的脂肽類抗生素表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和豐源素(fengycin)；核糖體途徑合成的肽類抗生素枯草菌素(subtilin)和類羊毛硫抗生素(lantibiotic-like peptides)[3-4]等。脂肽類物質在植物病害生物防治過程中發揮著重要的作用[5-12]，其結構一般是由1個β-羥基脂肪酸與7～10個氨基酸以酰胺鍵形式連接的環肽[13]。Iturin家族的脂肽類化合物由七肽與14～17個碳原子的β-氨基脂肪酸鏈相連而成，包括7個異構體iturin A、iturin C、桿菌抗霉素(bacillomycin)D、bacillomycin F、bacillomycin L、bacillomycin LC和抗霉枯草菌素(mycosubtili)。在體外檢測中，iturin表現出廣譜的抗真菌活性和微弱的抑細菌活性，主要抑制真菌生長[14-18]。Surfactin家族脂肽類化合物是七肽與β-羥基脂肪酸交聯形成的內酯環狀結構，細分為surfactin A、surfactin B、surfactin C1、surfactin C2等，主要抑制細菌、病毒、支原體生長[18-19]。Fengycin是由十肽與β-氨基脂肪酸鏈(C14～C18)形成的內酯環，包括fengycinA和fengycinB這2類——對絲狀真菌有強烈的抑制作用。另有研究表明，surfactin與iturin、surfactin與fengycin、iturin與fengycin兩兩之間存在協同效應，能夠有效地增強后者的抑菌活性[18，20-21]。

芽孢桿菌脂肽類抗生素合成基因的特點是抗生素合成受一個大的基因簇控制，基因簇由合成基因、調控基因共同組成[22]。脂肽類抗生素是通過非核糖體途徑合成的，其合成酶須要翻譯后經修飾才有活性，該過程由共價調節酶磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶(phosphopantetheinyl transferase，PPTases)催化[23]。Surfactin由surfactin合成酶，即非核糖體多肽合成酶(nonribosomalpeptide synthetases，NRPS)催化得到，在sfp基因缺失的情況下將不能產生surfactin，將外源基因整合入枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)168菌株中，使其產surfactin[24]。在枯草芽孢桿菌168中由于沒有編碼PPTases的基因，盡管其含有surfactin和fengycin等2種脂肽類抗生素合成酶基因，卻不產生任何脂肽類抗生素[23]。芽孢桿菌脂肽的快速檢測一般采用分析化學的方法，如高效液相質譜、核磁共振等方法。目前，用分子生物學來檢測芽孢桿菌脂肽類物質越來越普遍，根據芽孢桿菌脂肽的生物合成相關基因(sfp、srf、fenD、ituC、bmyB等)設計引物，從而快速檢測抗菌脂肽。

前期研究發現，筆者所在實驗室獲得的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)HAB-6菌株具有廣譜抑菌活性，本研究對HAB-6菌株產脂肽類物質的機制進行初步探究，表明其基因組中含有脂肽類物質的合成基因和調控基因，可以為今后研究HAB-6菌株中脂肽類物質的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌HAB-6菌株由筆者所在實驗室從豇豆中分離得到；芒果炭疽病菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)為筆者所在實驗室保存，作為HAB-6菌株抑菌活性測定的主要靶標菌；感受態細胞為筆者所在實驗室保存的大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α。

1.2 培養基

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g，NaCl 10 g、5 mol/L NaOH調節pH值至7，用去離子水定容至 1 L；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、去離子水定容至1 L。

1.3 HAB-6菌株脂肽類合成基因PCR檢測

HAB-6菌株接種于LB培養基中，在28 ℃、180 r/min條件下培養48 h。提取HAB-6菌株總DNA，以總DNA為模板，分別用10對ituC、srfAB、sboA、ituD、qk、fenD、bamC、yndj、ituB、fenB脂肽類抗生素合成相關基因引物[25](表1)，進行靶標基因的PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 60 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經電泳膠回收后進行TA克隆，轉化后送華大基因公司測序，測序結果經Blast比對分析。

表1 HAB-6菌株擴增基因及引物序列

1.4 脂肽類關鍵合成酶基因PCR擴增

以HAB-6菌株總DNA為模板，分別用6對脂肽類關鍵合成酶基因ituA、ituD、lpa-14、sfp、mycB、fenB的引物進行靶標基因的PCR擴增。PCR擴增產物經電泳膠回收后進行TA克隆、轉化后送華大基因測序，結果經NCBI數據庫Blast比對分析。

表2 擴增基因及引物序列

1.5 酸沉淀法提取脂肽類物質

HAB-6菌株發酵液于10 000 r/min離心10 min，去除菌體得離心上清液，6 mol/L的HCl溶液調pH值至2.0，4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，用甲醇溶液溶解沉淀，為脂肽類物質粗提物[9]。用濾紙片法檢測脂肽類物質的抑菌活性。

1.6 LC-MS色譜條件

色譜柱SMB200-12C18柱(4.6 mm×250 mm，12)；流動相為0.05%甲酸水溶液(A) ∶乙腈(B)，梯度洗脫(表1)；流速為 1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長235 nm；進樣量20 mL[22]。

表3 分析色譜梯度洗脫程序

1.7 脂肽類物質粗提物抑菌活性檢測

將芒果炭疽病菌接種于9.0 cm PDA培養平板中央，在距離中央2.5 cm的位置等距離接種HAB-6菌體和濾紙片，每片濾紙片上加15 μL HAB-6菌株發酵上清液和脂肽類粗提物，將培養皿倒置于28 ℃培養箱中培養5 d，觀察。

2 結果與分析

2.1 脂肽類基因序列檢測

用10對引物擴增，HAB-6菌株中分5個基因片段ituC、srfAB、ituD、fenD、yndj與目標片段長度一致(圖1)。對擴增得到的5個基因片段進行測序，經NCBI的Blast比對分析，分別為ituC、srfAB、ituD、fenD、yndj，條帶大小與目標條帶大小一致。其中HAB-6菌株中的ituC基因序列與B.subtilisB010菌株的ituC基因(GU062715.1)同源性達到97%，HAB-6菌株中的srfAB基因序列與B.amyloliquefaciens菌株的srfAB基因(AJ575642.1)同源性達到96%，HAB-6菌株中的ituD基因序列與B.amyloliquefaciensQ-426菌株的ituD基因(JQ271536.1)同源性達到98%，HAB-6菌株中的fenD基因序列與B.amyloliquefaciensSQR9菌株的fenD基因(CP006890.1)同源性達到98%，HAB-6菌株中的yndj基因序列與B.amyloliquefaciensSQR9菌株的yndj基因(JN093032.1)同源性達到97%。

2.2 脂肽類合成酶基因序列檢測

用10對引物擴增，HAB-6菌株中得到5個基因片段ituA、lpa-14、sfp、mycB、fenB與目標片段長度一致(圖2)。對擴增得到的5個基因片段進行測序，經NCBI的Blast比對分析，HAB-6 菌株中的ituA基因序列與B.amyloliquefaciens菌株的ituA基因(KF765804.1)同源性達到98%；HAB-6菌株中的lpa-14基因序列與B.subtilisRP24菌株的lpa-14基因(EU797520.1)同源性達到98%；HAB-6菌株中的sfp基因序列與B.amyloliquefaciensS20菌株sfp基因(JX414225.1)同源性達到99%；HAB-6菌株中的mycB基因序列與B.amyloliquefaciensQ-426菌株的mycB基因(JQ271536.1)同源性達到96%；HAB-6菌株中的fenB基因序列與B.amyloliquefaciensS20菌株的fenB基因(JX414225.1)同源性達到96%。

2.3 HAB-6菌株脂肽類抗生素組成

通過HAB-6菌株脂肽類物質粗提物的液質聯用可以發現，保留時間在3.31、7.70、24.67、25.35 min對應的相對分子質量分別為1 041.5、1 083.6、1 006.6、1 034.7(圖3)，與脂肽類物質相對分子質量吻合(表4)。質荷比(m/z) 1 042.5、1 084.6、1 007.6、1 035.7所對應的脂肽類抗生素為C14Iturin A、C17Iturin A、C13Surfactin A、C15Surfactin C[26]。

2.4 脂肽類物質活性檢測

通過對峙培養，顯示HAB-6菌株及其發酵上清液均對芒果炭疽病菌有明顯的抑制作用，產生明顯的抑菌帶，但將HAB-6菌株發酵離心上清液通過酸沉淀法提取的脂肽類物質對芒果炭疽病菌沒有抑菌活性，說明脂肽類物質不是 HAB-6 菌株的抑菌活性物質(圖4)。

3 結論與討論

芽孢桿菌在自然生長和發酵培養后期產生的脂肽類物質是其最重要的抗菌物質[26]。Iturin只限于枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌中產生，抑制植物病原菌。Iturin家族通過與細胞膜相互作用引起孔隙形成，普遍對多種真菌有較強的抗真菌活性[27]。于是根據已知脂肽類物質的基因序列設計引物進行PCR，與已知基因經Blast比對，顯示HAB-6菌株有合成脂肽類物質的5條基因。進一步設計引物對合成脂肽類物質關鍵酶基因進行擴增，HAB-6菌株含有編碼關鍵酶的5條基因。Sfp基因編碼的4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺苷酰轉移酶是芽孢桿菌非核糖體途徑脂肽類物質合成的關鍵基因。SrfAB編碼surfactin合成酶，surfactin合成酶通過磷酸泛巰基轉移酶將4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺苷酰轉移酶以硫酯鍵連接到PCP結構域上[26-30]，活化后啟動surfactin的合成[23]。在B.subtilis168中由于沒有編碼PPTases的基因，即sfp，盡管其含有surfactin和fengycin這2種脂肽類抗生素合成酶基因，卻不產生任何脂肽類抗生素[26，31]。筆者所在實驗室另一株解淀粉芽孢桿菌HAB-2菌株缺失sfp基因，但有lpa-14基因，同樣能產生有抑菌活性的脂肽類物質。HAB-6菌株含有編碼4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺苷酰轉移酶的sfp基因、lpa-14基因以及編碼surfactin合成酶的srfAB基因，從基因的角度初步推測 HAB-6 菌株產生的脂肽類物質應具有抑菌活性。

通過LC-MS可以看出，HAB-6菌株代謝產生了 C14Iturin A、 C17Iturin A、 C13Surfactin A、C15Surfactin C等脂肽類物質。Iturin類家族的脂肽類化合物在抑制真菌病害中起著重要作用[9-10]。最近，Tanaka等研究表明，Iturin類化合物抗真菌活性隨側鏈長度增加：C17>C16>C15[28]。很多研究顯示脂肽類物質具有相互協同作用[29]。對峙培養結果顯示，HAB-6菌株以及其發酵液有抑制芒果炭疽病菌的活性，但是從HAB-6菌株發酵液中提取的脂肽類化合物沒有抑制真菌的活性。說明提取的脂肽類物質不是HAB-6菌株抑制真菌的主要物質。Surfactin家族主要抑制細菌、病毒，對真菌沒有明顯的抑制作用，可能HAB-6菌株代謝產生的脂肽類物質中以surfactin為主。因此，HAB-6菌株脂肽類物質代謝途徑以及抑菌活性物質的分離純化還有待進一步研究。

表4 HPLC-ESI-MS脂肽類物質活性檢測分析

解淀粉芽孢桿菌HAB-6具有脂肽類物質的合成基因yndj、srfAB、ituD、fenD、ituC和調控基因fenB、lpa-14、sfp、mycB、ituA，代謝產生C14Iturin A、C17Iturin A、C13Surfactin A、C15Surfactin C，但是酸沉淀提取得到的脂肽類物質不是 HAB-6 菌株抑制真菌的主要物質。

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