小飛蓬耐鉛內生細菌的分離及其16S rDNA鑒定

劉希華， 江丹丹， 文 欣

(1.福建省資源環境監測與可持續經營利用重點實驗室，福建三明 365004； 2.三明學院資源與化工學院，福建三明 365004)

小飛蓬(Conyzacanadensis)別稱加拿大飛蓬，屬菊科白酒草屬，為一年生草本植物，廣泛分布在福建省各地，具有生命力強、生長迅速、生物量大的特點，在礦區有很強的生長優勢。楊剛等對四川甘洛鉛鋅礦廢棄礦區和尾礦庫區自然生長的15種草本植物進行調查發現，不同植物地上部分體內重金屬鉛(Pb)、鋅(Zn)、鎘(Cd)的富集量以小飛蓬最高[1]，小飛蓬富集土壤中Pb的方式是利用它們植物穩定化(固定化)的作用吸收固定土壤中的Pb[2]，其中葉片吸收囤積的重金屬元素最多，達到147.105 8 mg/kg，遠高于其根、莖部所吸收囤積的重金屬元素量。因此，在治理土壤中的鉛污染時，可以通過大面積收割鉛污染區小飛蓬地上部分來治理回收利用重金屬[3]。

對福建省重金屬污染現狀的調查結果表明，重點防控的重金屬污染物為鉻(Cr)、鉛(Pb)，而三明市則以鉛為重點防控的重金屬污染。小飛蓬生長緩慢，植株矮小，地上部生物量小，在實際應用中受到很大的限制。植物內生細菌(endophytic bacteria)是從植物內部得到的并且可以定殖于健康植物體內的，或者從表面消毒的植物組織中分離得到的各類菌，但是不會改變植物的表型特征和功能[4]。學者們通過研究發現，內生細菌對植物的生長具有促進作用，不僅可以緩解重金屬的毒性，而且會對土壤中的重金屬生物有效性產生影響[5-11]。目前，在內生細菌與植物相聯合對重金屬污染的土壤進行修復方面已經有了一些研究，還取得了很好的治理效果[12-14]，但是對小飛蓬內生菌的研究還未見報道。本研究以小飛蓬根莖葉為材料，采用常規方法分離內生細菌并對其進行生理生化和分子進化檢測，以了解小飛蓬耐鉛內生細菌種類組成，嘗試從內生細菌特性方面對小飛蓬的耐鉛脅迫特性進行探索。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 小飛蓬 野生盆栽小飛蓬，等小飛蓬長到高約為 50 cm 時，分別用配制的濃度梯度為0(空白對照組)、0.3、0.6、0.9、1.2 mmol/L的硝酸鉛溶液澆灌盆栽小飛蓬，3 d澆灌1次，1個月后，正常澆自來水2個月，采集長勢好、無病害小飛蓬根、莖、葉3個部分進行內生細菌分離。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基：3 g/L牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L NaCl，固態培養基另加瓊脂20 g/L，調節pH值至7.4，121 ℃滅菌20 min。

配制鉛濃度分別為0、0.3、0.6、0.9、1.2 mol/mL的牛肉膏蛋白胨培養基。

1.2 內生細菌的分離和純化

將小飛蓬根、莖、葉3個部分分別用5%洗潔精浸泡 5 min，于流水下沖洗干凈，在無菌操作臺上，用75%乙醇振蕩沖洗 2 min，再用無菌水振蕩沖洗5次，以最后1次漂洗液涂布于培養基上做滅菌效果檢測。將滅菌材料置于無菌研缽中，加入適量無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)和石英砂進行研磨至漿狀。將勻漿液轉入離心管中，2 000 r/min離心2 min，取上層澄清液涂布于固態培養基中，每個鉛濃度設3次重復。于37 ℃培養至長出單菌落，反復劃線至得到純培養菌株。

1.3 形態及生理生化鑒定

純化菌株采用常規方法進行革蘭氏染色、檸檬酸鹽反應、接觸酶反應、甲基紅試驗和VP試驗等檢驗[15]。

1.4 分子鑒定

采用3S柱離心式環境樣品DNA回收試劑盒V2.2提取分離菌株基因組DNA，以通用引物8f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′)(上海華大基因科技有限公司)進行PCR擴增。50 μL PCR擴增體系如下：5 μL 10×PCR buffer(2.0 mmol/L MgCl2)，4 μL dNTPs(10 mmol/L )，1 μL 8f(10 mmol/L)，1 μL 1492r(10 mmol/L)，1 μLTaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)，1 μL模板DNA。PCR擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 7 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。回收1 700 bp左右的PCR產物并連接到pMD19-T Vector，挑取陽性克隆送往上海華大基因公司測序。

序列經Blast進行最大相似性比對，用 Clustal X 1.83[16]進行同源性分析，用來自MEGA(2.1)的鄰接(neighbor-joining，簡稱NJ)法[16]構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 內生菌的分離與純化

小飛蓬表面滅菌處理后，經涂布檢測表明滅菌徹底。通過小飛蓬不同部位、不同鉛濃度培養基平板的分別培養，共分離到31株內生細菌，在根的部位分離到14株，莖的部位分離到7株，葉的部位分離到10株(表1)。在不同鉛離子濃度的平板培養基上，0、1.2 mol/mL鉛離子濃度培養基中無菌株產生；0.3 mol/mL鉛離子濃度培養基上分離到最多的內生菌，達到13株；0.9 mol/mL鉛離子濃度培養基上分離到11株內生菌；0.6 mol/mL鉛濃度培養基上分離到7株內生菌。

2.2 形態學與耐鉛生理濃度檢測

由表2可以看出，經革蘭氏染色、顯微鏡觀察，所有菌株均為G+菌，接觸酶反應都為陽性(+)，甲基紅試驗測定結果均為陰性(-)，24株菌檸檬酸鹽反應結果為陽性(+)，21株菌VP試驗結果為陽性(+)。

表1 小飛蓬分離菌株情況

表2 生理生化結果

2.3 內生菌株16S rDNA基因序列分析及系統發育樹構建

對小飛蓬31株內生細菌DNA進行PCR擴增后，擴增產物長度均為1 500 bp左右。小飛蓬內生細菌的16S rDNA測序結果表明，部分內生菌為同種，經過合并歸類后，得到5種小飛蓬內生菌(CC2、CC6、CC14、CC16和CC23)。經過BLAST檢索，找到與之相似性最高的種屬。

將上述5個菌株與其同源性較高的菌株16S rDNA序列利用MEGA(2.1)程序包構建發育樹(圖1)。根據系統發育樹，可以推斷CC2、CC6、CC16和CC23在遺傳距離上較為接近，聚為一類。同時，從遺傳距離上來看，這4個菌株與短芽孢桿菌屬(Brevibacillussp.)較為接近，表明這4個菌株與短芽孢桿菌屬在系統發育上的親緣關系較近。CC14則與節桿菌屬(Arthrobactersp.)在遺傳距離上較為接近，表明這二者在系統發育上的親緣關系較近。根據16S rDNA分類標準，一般認為，屬于同一個種的16S rDNA序列同源性大于99%，歸為一個屬的可以認為同源性在95%～99%之間。據此推斷，所分離的小飛蓬內生細菌CC2、CC6、CC16和CC23是短芽孢桿菌屬，CC14是節桿菌屬。

3 結論與討論

本研究通過分離純化鉛脅迫下的小飛蓬根莖葉的內生菌，共得到31株內生細菌，在根的部位分離到14株細菌，在莖的部位分離到7株細菌，在葉的部位分離到10株細菌。得到的菌株經過革蘭氏染色等生理生化檢測和內生菌基因組DNA提取、16S rDNA擴增和系統進化樹的構建等分子檢測分析方法，推測所分離到的菌株中CC2、CC6、CC16和CC23是短芽孢桿菌屬，CC14是節桿菌屬。植物內生菌是與植物組織共生在一起的，長期存在于植物組織內部，內生菌的存在能促進植物生長，在某些重金屬污染地區，可增強植物抗逆能力，提高生物修復能力[17]。柯野等從大寶山礦區重金屬污染的土壤中分離到類短短芽孢桿菌(B.parabrevis)，對發酵液中鉛的去除效率高達30.27%[18]，但并未探明該菌株富集鉛離子的機制。節桿菌菌屬菌株對沉淀態鉛有很強的活化效能[19]，以及對鉛的高抗性水平[20]、吸附鉛效果較好[21]等一些富集鉛的功能。對節桿菌富鉛的生理生化研究也表明，節桿菌菌屬菌株對鉛的吸附主要是通過細胞成分中的磷酸基團、羰基、羥基、酰胺基團、羧基等活性基團與鉛離子發生絡合作用[21]，吸附鉛后可誘導鉛離子在細菌表面形成含鉛的礦物[22]。本研究首次從植物(小飛蓬)中分離到鉛富集內生菌菌株(短芽孢桿菌屬和節桿菌屬)，說明這些菌株是可以與植物進行共生的，但是由于小飛蓬生長緩慢，所以在植物修復重金屬污染方面的效果不明顯，因此下一步的試驗將著眼于將分離的菌株與其他生長快速、生物量大的植物進行共生，將有助于重金屬污染地區的土壤修復研究。

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