一株磺化瀝青降解菌的篩選鑒定及降解特性研究

幸晶晶 ， 馬立安 ， 余維初

（1.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京102206；2.長江大學生命科學學院，湖北荊州434025；3.長江大學化學與環境工程學院，湖北荊州434025）

0 引言

鉆井廢水成分復雜、水質多變、排放點分散，其主要水質表征為：COD濃度高，廢水可生化性差；色度較高；固體懸浮物含量較多[1-3]。三磺鉆井液體系是國內油田普遍采用的一種性能優良、價格低廉的耐高溫型鉆井液體系，主要用于井深達到2000～3000 m以上時的深井鉆井過程，目前在國內各油田都有大量的使用。三磺鉆井液體系就是添加劑主要組成為磺化酚醛樹脂（SMP）、磺化褐煤（SMC）、磺化烤膠（SMK）、磺化瀝青等的鉆井液體系，也稱為磺化鉆井液體系[4]。

磺化瀝青是一種以石油烴基化合物為原料經過硫酸等物質進行復雜的化學處理而得到的一種改性的高分子化合物。是經過磺化、氧化和乳化等改性化學處理得到的產品[5-8]。該實驗旨在研究三磺鉆井液體系中的磺化瀝青的降解菌及降解特性。

對于油田鉆井廢液的處理方法主要有物化法、化學法、生物法組合和工藝處理法4大類[9-11]。其中物化法、化學法及工藝處理法在處理過程中存在造價過高或處理不達標及造成二次污染等其他問題[12-18]。隨著微生物處理技術的深化研究和工程實踐經驗的積累，生物處理技術在有毒、有害有機工業廢水的治理中已得到了廣泛的應用[19-22]。張淑俠等[23]針對聚磺鉆井液廢水中有機物含量高、降解難度大的特點，研究了用高效復合菌劑 BS5 處理經生化預處理工藝后排出的廢水， 當優勢菌劑加量為 0.5 g·L-1， 曝氣量為 0.25 L·min-1， 污泥沉降比為25%～35%時， COD去除率大于87%。馮栩等[24]通過從受鉆井廢水污染的土壤樣品中篩選菌株進行生物處理實驗[25]，并加入20 mg·L-1的硫酸銨來提高降解率，用其處理COD范圍為1369～1655 mg·L-1的鉆井液廢水，通過曝氣作用，使得有機物去除率達到42%，且運行過程中耐沖擊負荷性和穩定性均較好。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

菌種來源：新疆克拉瑪依油田磺化鉆井液，鉆井口附近離地表15～20 cm的油田鉆井液，進行多點取樣后裝入無菌袋存于實驗室4 ℃冰箱中密封保存。

磺化瀝青：由重慶大方提供。

1.1.2 培養基

基礎培養基 ： 5 g 牛肉膏、 10 g 蛋白胨、5 g NaCl 、1 L 蒸餾水、pH 值 為 7.0。

無 機 鹽 培 養 基 ： 0.5 g KCl、1.5 g NaNO3、1 g K2HPO4、 0.5 g MgSO4、 1.5 g （NH4）2SO4、5 g NaCl、 0.01 g CaCl2、 0.01 g FeSO4、 1 L H2O。

富集馴化/篩選降解培養基：無機鹽培養基加入0.5%的磺化瀝青。

分離培養基：富集馴化/篩選降解培養基加入50%的基礎培養基，2%瓊脂。

擴大培養基：富集馴化/篩選降解培養基加入50%的基礎培養基。

1.2 方法

1.2.1 菌種的富集、馴化

分別稱取各污染土壤1 g，加入到以磺化瀝青為唯一碳源的富集馴化培養基中進行富集、馴化。培養條件為 35 ℃、150 r/min，培養 5 d 后進行轉接，吸取5 mL馴化菌液，加入到新的篩選培養基中進行傳代馴化。馴化周期為5 d，連續馴化5個周期后，加入到分離擴大培養基進行擴大培養，獲得以磺化瀝青為唯一碳源生長的混合菌液。

1.2.2 菌種的分離、純化、篩選

取混合菌液，10倍系列稀釋涂布于分離培養基上，35 ℃培養獲得單菌落。觀察菌落生長情況，根據菌落顏色、形態、大小、邊緣特征等挑選不同類型的單菌落，命名為X1-n。再進行劃線分離、純化，鏡檢，獲得純種單菌落，回接篩選培養基中篩選降解效果，對降解效果好的純種單菌落做生理生化及分子鑒定。

1.2.3 菌種的生理生化及分子鑒定

（1）生理生化鑒定：參考《伯杰細菌手冊》進行初步鑒定。

（2）分子生物學鑒定：用接種環挑取少量菌體，置于1.5 mL離心管中，加入30 μL去離子水，振蕩使菌體分散，蓋緊離心管并用封口膜密封，置于微波爐中使用中火加熱2 min，加熱后立即將離心管冰浴 2 min，然后 12 000 r/min，離心 1 min，吸上清液置于-20 ℃備用。以提取細菌DNA為模板，通用引物（27F和1492R）擴增16S rRNA基因，PCR 反 應 體 系 為（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物 27F/1492R（10 μmoL）各 2 μL，模板 DNA 3 μL，ddH20 18 μL。PCR 反應程序為 ：94 ℃ 4 min ；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個循環，72 ℃10 min。PCR產物經電泳檢測后，交至武漢生工測序公司測序。測序結果在NCBI中進行比對分析，并通過MEGA 5.0構建系統發育樹。

1.2.4 菌種的降解特性研究

1）單因素實驗。

①溫度：準確量取50 mL的篩選培養基于150 mL的錐形瓶中，接入5%的擴大培養菌液，分別放在25、28、31、34、37 ℃（分別設為 W1、W2、W3、W4、W5），轉速為 150 r/min 的恒溫搖床中，培養7 d，5個周期，分別測定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳生長溫度。

②pH值：準確量取50 mL的篩選培養基于150 mL的錐形瓶中，分別調pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5（分別 設 為 pH值 1、pH 值 2、pH 值 3、pH 值 4、pH 值 5），接入 5% 的擴大培養菌液，34 ℃、150 r/min下培養7 d，5個周期，分別測定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳生長pH值。

③P源：準確量取50 mL的篩選培養基于150 mL的錐形瓶中，將培養基的P源分別配制為K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4（ 分 別 設為 P1、P2、P3、P4），在 34 ℃、150 r/min 下培養7 d，5個周期，分別測定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳生長磷源。

④N源：準確量取50 mL的篩選培養基于150 mL的錐形瓶中，將培養基的N源分別配制為NaNO3、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH4NO3、KNO3（分別設為N1、N2、N3、N4、N5），接入5%的擴大培養菌液，在 34 ℃、150 r/min 下培養 7 d，5 個周期，分別測定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳生長氮源。

⑤鹽濃度：準確量取50 mL的篩選培養基于150 mL的錐形瓶中，將NaCl分別按0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（分別設為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5）的量配制培養基，接入5%的擴大培養菌液，在 34 ℃、150 r/min 下培養 7 d，5 個周期，分別測定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳鹽濃度。

⑥接種量：準確量取50 mL的篩選培養基于150 mL的錐形瓶中，分別按2%、4%、6%、8%、10%（分別設為J1、J2、J3、J4、J5）接入擴大菌液。34 ℃、150 r/min 下培養 7 d，5 個周期，分別測定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳接種量。

2）正交實驗。

根據單因素實驗結果，確定最佳P源N源后，選取溫度、pH值、鹽濃度和接種量進行正交實驗。在最佳條件下設置3組平行實驗，培養7 d、5周期后，測量菌株生長量以及COD的降解率。

1.2.5 COD降解率的測定

使用DR1010COD測定儀測定磺化瀝青培養基的COD值。使用移液管吸取2 mL樣品加入到消解管中，緩慢上下顛倒多次以后用干凈的紙巾擦干，并采用等量去離子水設置為對照。將加入了樣品的消解管插入預熱的DRB200反應器中加熱2 h。反應完成后。待溫度降低到120 ℃時便可以取出，輕輕晃動待消解管冷卻到室溫后使用比色法測定COD。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離、鑒定

經過富集、馴化、純化分離后，得到能以磺化瀝青為唯一碳源生長的菌株。形態、生理生化及分子生物學鑒定，結果如圖1、圖2。

圖1 X2的顯微結構鏡檢圖

圖2 X2菌株系統發育樹

由圖1可知，該菌為產芽孢的短桿菌。圖2結果表明X2與大洋沉積芽孢桿菌相似度最高，暫命名為大洋沉積芽孢桿菌X2。

2.2 降解特性研究

2.2.1 單因素實驗

1）溫度對X2生物生長量的影響。溫度條件處理對X2的生物生長量影響如圖3所示，對培養5個周期的菌液進行OD600的吸光度測量。由圖3可知，5個周期過程中，菌株生長量呈緩慢增長的趨勢。其中W4條件下菌株的生長量最大，確定溫度為34 ℃時是最佳培養條件。

圖3 不同溫度處理對菌株X2生長量的影響

2）pH值對X2生物生長量的影響。pH值條件處理對X2的生物生長量影響如圖4所示，對培養5個周期的菌液進行OD600的吸光度測量。由圖4可知，5個周期過程中，菌液生長狀態起伏較大。其中在第5個周期時pH值為4狀態下菌株的生長量最大，確定pH值為8.0時是最佳培養條件。

圖4 不同pH值處理對菌株X2生長量的影響

3）P源對X2生物生長量的影響。不同P源條件處理對X2的生物生長量影響如圖5所示，對培養5個周期的菌液進行OD600的吸光度測量。由圖5可知，5個周期過程中，菌液生長狀態起伏較小，但不同P源處理間的差異較大。其中在P2的處理狀態下菌株的生長情況處于先上升后平緩的趨勢，并且在第2、3、4周期時均大于其他P源處理下的生長量。因此確定P源為KH2PO4時是最佳培養條件。

圖5 不同P源處理對菌株X2生長量的影響

4）N源對X2生物生長量的影響。不同N源條件處理對X2的生物生長量影響如圖6所示，對培養5個周期的菌液進行OD600的吸光度測量。

圖6 不同N源處理對菌株X2生長量的影響

由圖6可知，5個生長周期過程中，同種處理不同階段下的菌液生長量差異較小。但是不同N源處理下的菌液生長量差異較大，其中N4處理狀態下菌液生長量最大。因此確定N源為NH4NO3時為最佳培養條件。

5）鹽濃度對X2生物生長量的影響。不同NaCl濃度條件處理對X2的生物生長量影響見圖7，對培養5個周期的菌液進行OD600的吸光度測量。

圖7 不同鹽濃度處理對菌株X2生長量的影響

由圖7可知，5個周期過程中，5種處理條件下的菌液生長均呈現上升狀態。其中Y5處理條件下菌株的生長量最大，確定鹽濃度為1%時是最佳培養條件。

6）接種量對X2生物生長量的影響。不同接種量條件處理對X2的生物生長量影響如圖8所示，對培養5個周期的菌液進行OD600的吸光度測量。由圖8可知，5個周期過程中，5種處理條件下的菌液生長均呈現上升狀態。其中J5處理條件下菌株的生長量始終大于其他4個條件處理。確定接種量為10%時是最佳培養條件。

圖8 不同接種量處理對菌株X2生長量的影響

2.2.2 正交實驗

1）X2生長量正交實驗結果如表2。在單因素實驗中確定P源為KH2PO4，N源為NH4NO3為最佳條件下，設置不同溫度、pH值、鹽濃度和接種量進行正交實驗。

表2 X2生物量正交實驗及其分析表

由表2可以看出，X2菌株在溫度為36 ℃、pH值為7.8、鹽濃度為1%、接種量為10%時為最佳培養條件。其中pH值的R極差最大，是影響菌株生長的關鍵因子，其次為鹽濃度、溫度、接種量。

2）X2的COD降解率正交實驗結果如表3。由表3可以得出，COD最佳降解條件：溫度為36℃、pH值為8.2、鹽濃度為0.9%、接種量為12%，降解率在59%～71%，在34 ℃、pH值為8.2、鹽濃度為0.9%、接種量為10%時降解率達到最大值71%。pH值的R極差最大，達到0.068，其次為溫度、接種量、鹽濃度。

表3 X2的COD降解正交實驗及其分析表

3 結果與討論

獲得一株降解磺化瀝青的芽孢短桿菌，命名為大洋沉積芽孢桿菌X2。單因素試驗結果顯示：X2分別在溫度為34 ℃、pH值為8.0、P源為KH2PO4、N源為NH4NO3、鹽濃度為10%、接種量為10%時為最佳生長環境。正交實驗結果確定當溫度為36 ℃、pH值為8.2、鹽濃度為0.9%、接種量為12%，X2對磺化瀝青COD的降解率達59%～71%。pH值的R極差最大，是同時影響菌株生長及COD降解的關鍵因子，其次為溫度、接種量、鹽濃度。

利用微生物降解磺化瀝青，降解過程中微生物生長情況良好，可以反映出磺化瀝青得到了一定的降解。但是在離心過程中容易產生誤差，故而建議在后期研究過程中可以選擇測量濃度及結構式進一步確定磺化瀝青的降解效率。在正交實驗過程中，菌體生長的最佳條件與降解的最佳條件不完全相同，因此在降解修復過程需要采取分段式控制其參數，有利于菌體生長與降解COD均在最佳條件下進行。在最佳降解條件下的COD 降解率有待下一步驗證試驗進一步研究。