核桃多酚化學及生物活性研究進展

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(北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京工商大學,北京 100048)

核桃(JuglansregiaL.)是胡桃科核桃屬多年生落葉喬木,又名胡桃、羌桃,與扁桃、腰果、榛子并列為世界四大干果,分布在世界上許多國家。我國核桃資源豐富,為核桃生產大國,栽培的核桃品種約為40個。核桃不僅是一種味美價廉的干果,而且富含不飽和脂肪酸、多酚類成分、蛋白質及多種微量元素,具有豐富的營養價值。核桃多酚是核桃中所有酚類物質的總稱,主要為鞣花單寧、沒食子酸、鞣花酸、丁香酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、兒茶素等[1],分布在核桃仁、青皮、葉片及核桃殼等部位。現代醫學與營養學研究證實,核桃多酚具有抗氧化、神經保護、降脂、降糖、抗腫瘤及抑菌等多種生物活性,被認為是核桃中最重要的功效組分之一[2]。我國人口老齡化日益嚴重,對阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)、腦衰老及心腦血管等衰老相關疾病的防治面臨著的嚴峻形勢,核桃多酚可能在防治相關疾病中具有良好的應用和開發前景。本文從近年來核桃多酚的化學和生物活性的研究進行綜述,為核桃多酚的進一步研究和開發提供有益的參考。

1 核桃多酚的化學研究

核桃中含有多種對人類健康有重要作用的酚類物質,Regueiro檢測出核桃多酚含有鞣花單寧、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、槲皮素、綠原酸、原花青素、香豆酸、木麻黃素等120多種酚類化合物[3]。其中鞣花單寧具有很好的預防心血管疾病、抗氧化和抗癌作用,是核桃多酚中最主要的酚類化合物[2,4]。核桃在貯藏加工過程中多酚含量會發生變化,目前關于貯藏和加工對核桃中多酚含量變化的研究報道并也不一致。王俊轉研究發現冷藏或烘干核桃青皮中單寧含量均會下降[5],而冀愛青[6]等研究發現鮮核桃果實中的多酚和黃酮含量在貯藏早期呈現明顯增加現象。本實驗室的前期研究發現,與青皮核桃相比,烘干,炒制及脫殼等加工方式可增加核桃仁中總多酚,黃酮和鞣花酸含量,并且加工后的核桃果實的抗氧化能力更強,這與大眾普遍認為的新鮮的青皮核桃更營養并不一致。下面對近年來有關核桃多酚的提取、分離純化和結構鑒定等研究方法進行分析和討論,為核桃多酚的研究和開發提供參考。

1.1 核桃多酚的提取分離

核桃多酚的提取受多酚化學結構、提取方法、提取條件、樣品采集、貯存條件及時間的影響,不同樣品及其方法對多酚的提取收率都有很大影響。核桃多酚的提取工藝一般包括溶劑萃取法、超聲輔助浸提法、微波輔助浸提法等。目前核桃多酚主要采用有機溶劑萃取法提取,常用的溶劑為甲醇、乙醇、丙酮,但由于丙酮毒性大、易燃易爆、成本高等特性,在核桃多酚提取中較少使用,多采用醇提方法,提取的核桃仁粗多酚得率在4.5%～7%[7]。核桃多酚的提取得率主要與料液比、提取時間和提取溫度等因素有關。魏靜等[8]用正交試驗得出核桃種皮多酚的最佳提取工藝為60%的乙醇,料液比為1∶8,提取時間30 min,提取溫度55 ℃時多酚收率最大,為5.71 mg/g。超聲波和微波輔助能夠簡單、快速地提高常規溶劑萃取的效率,近年來在核桃多酚的提取中得到了廣泛的應用。王紅等[9]采用超聲波輔助提取核桃青皮單寧,將提取率從6 mg/g提高到10.49 mg/g。孫海濤等[10]采用超聲波-微波輔助聯合提取核桃殼中多酚,提取率為2.361%,提取效率遠高于傳統常規溶劑浸提法。在核桃多酚的分離提取中溶劑萃取法有機溶劑用量大且萃取時間長,有成本高和收率低等缺點,但由于它簡便、可大劑量提取等特點,目前核桃多酚多數還是采用溶劑萃取法提取。微波和超聲波輔助提取法在溶劑萃取條件下縮短了提取時間和提高了提取收率,在近幾年廣泛應用于多酚物質的提取中。這幾種方法中不同樣品的最佳提取條件極難控制,且微波輔助提取中的導致局部急速升溫,溫度難以控制,這可能使多酚物質的結構發生改變,影響核桃多酚物質特性。總體來說,核桃多酚的提取技術還不完善,希望以后能將超臨界萃取技術、膜技術、生物酶解技術等廣泛應用于核桃多酚的提取中,加快核桃多酚的研究步伐。

通過有機溶劑初步萃取的粗多酚含有一定量的糖類、氨基酸等非酚類物質,因此,為進一步對核桃多酚進行深入研究,常常需要對粗多酚進行分離純化。常用于核桃多酚分離純化的方法有分級萃取法、大孔樹脂吸附法、葡聚糖凝膠色譜法。在分級萃取法分離核桃多酚部位實驗中,發現乙酸乙酯部位的抗氧化活性最高,且在乙酸乙酯部位分離出沒食子酸、沒食子酸乙酯、連苯三酚、原兒茶酸、香草酸、對羥基苯甲酸、五羥基二苯吡喃-6-酮等化合物[7]。Qiong[11]等用AB-8樹脂將核桃果皮的多酚純度提高了4.8倍。hang等[7]利用葡聚糖凝膠色譜從核桃仁中獲得對羥基苯甲酸、香草酸、沒食子酸乙酯、原兒茶酸、沒食子酸等成分。研究證明,山核桃多酚類物質中鞣花酸、沒食子酸和兒茶素的含量分別為25.2～47.1、6.5～13和62～106 mg/g[12]。分離純化中分級萃取法具有操作簡單、易于掌控的優點,但有機試劑用量大、成本較高。大孔樹脂對核桃多酚具有很好的富集作用且對有機物選擇性好、不溶于酸堿、不受強離子和無機鹽等穩定的理化性質使其常用于核桃多酚的初步純化,葡聚糖凝膠色譜法以分子質量大小來分離多酚物質,其良好的穩定性和重復利用性成為純化核桃多酚的常用工具。

1.2 核桃多酚的定性和定量分析

核桃多酚物質的研究需對多酚含量進行測定,同時,分離純化后的粗多酚可進行定性研究或者確定單一組分結構[13]。光譜分析法常用于核桃多酚的粗定量,如Carvalho等[14]以沒食子酸為標準物質,采用Fo1in-Ciocalteu法測定核桃仁、核桃葉、綠殼的甲醇和石油醚提取物的總酚含量,結果顯示核桃仁甲醇提取物中總酚含量最高為116.2 mg/g。核桃中單寧和黃酮含量的測定分別采用香草醛法和NaNO2-AlCl3比色法[15-16]。高效液相色譜法是核桃多酚定性鑒定及定量分析的常用方法,具有準確、靈敏、快速和分離效率高等優點。Fukuda等[17]利用正相及反相色譜技術(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC),從核桃仁中分離出3種未知水解單寧和12種已知單寧。萬正敏等[18]用HPLC法測得核桃仁中主要含沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素等八種多酚類物質,其中核桃仁種皮沒食子酸和蘆丁含量分別為146.2和187.6 mg/100 g,無種皮核桃仁兩者含量分別為5.3、0.9 mg/100 g,可以看出種皮內含有豐富的多酚成分。在核桃多酚未知化合物的檢測中常用色譜-質譜聯用技術進行分析,能準確的對核桃未知化合物進行定性和定量,其中毛細管電泳-質譜聯用(capillary electrophoresis-mass spectrometry,CE-MS)比液質聯用(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)更擅長分離極性或離子型化合物,如Gomez-Caravaca等[19]將核桃多酚化合物進行毛細管電泳-電噴霧質譜法(capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry,CE-ESI-MS)分析,結果顯示核桃仁多酚中含有兒茶素、綠原酸、鞣花酸、阿魏酸、香草酸、香豆酸、沒食子酸,且糖苷配基(苷元)和糖基化鞣花酸是核桃總酚中的主要物質,占總酚的64%～75%。Amaral等[20]對核桃葉的高效液相色譜-二極管陣列紫外檢測器-質譜(high efficiency liquid chromatography-diode array detector-mass spectrometer,HPLC-DAD-MS)分析,確定了7個酚類化合物且槲皮素-3-半乳糖苷是主要成分。高效液相色譜適用于高沸點、強極性和熱穩定性差的化合物分離分析,在核桃多酚分析中被廣泛應用。色譜-質譜聯用技術靈敏度高、分析速度快、分離效率高,定量的同時還可以對每種物質的結構進行解析,目前多采用HPLC-MS、CE-MS進行核桃多酚的分析。

2 核桃多酚的生物活性研究

多酚類成分廣泛分布于核桃的各個組織部位,不同部位的多酚類組成具有差異,因而生物活性也不同,如核桃青皮中含有豐富的5-羥基-1,4-萘醌、山柰酚、槲皮素等酚類物質,其抗菌及抗腫瘤效果顯著,核桃葉片中含有大量的槲皮素、綠原酸等多酚物質,具有良好的抗氧化及抗菌功效[21],而核桃仁部位種皮中多酚含量最高,主要為沒食子酸、鞣花酸、和兒茶素等,去掉種皮的核桃仁抗氧化性能會損失90%左右,提示種皮多酚為核桃仁中最主要的抗氧化活性成分。目前,在現代營養學領域和功能性食品開發中,核桃仁多酚受到更廣泛的重視。大量研究表明,核桃仁多酚具有良好的抗氧化、神經保護、降脂和降糖等生物活性,在食品和醫藥等領域應用前景廣闊。

2.1 抗氧化活性的研究

大量研究表明核桃多酚提取物具有典型的抗氧化作用。目前對核桃多酚的抗氧化評價與研究主要集中于三個水平:a.體外化學試驗;b.體外細胞水平;c.體內動物水平。首先目前研究和報道最多的是采用體外抗氧化實驗測定核桃多酚的抗氧化能力,研究表明核桃多酚在多項體外抗氧化試驗如DPPH、ABTS、FRAP、ORAC、超氧陰離子自由基清除等試驗中均表現出良好的抗氧化活性。核桃多酚目前主要采用有機溶劑提取法獲得,提取溶劑不同會使多酚提取物的抗氧化性存在較大的差異。對核桃仁的甲醇、乙醇、丙酮和水提物進行DPPH、ABTS、FRAP、ORAC抗氧化能力的比較中,甲醇提取物的抗氧化能力最高[22-23]。此外,研究表明核桃多酚在體外還具有抑制低密度脂蛋白氧化的作用,Anderson等[24]以鞣花酸為對照,進行體外的血液和低密度脂蛋白抗氧化試驗,鞣花酸和核桃提取物對2,2′-偶氮-瞇基丙烷(AAPH)誘導的低密度脂蛋白氧化的抑制率分別為87%和38%,而對Cu2+催化的低密度脂蛋白氧化的抑制率分別為14%和84%,可以顯著抑制血漿中硫代巴妥酸反應物的形成。

核桃多酚不僅具有良好的體外抗氧化活性還在體外細胞水平和體內動物水平上具有優異的抗氧化性。研究證明核桃多酚在細胞和動物體內可通過降低氧化應激水平來發揮對抗氧化應激性損傷和抗衰老等生理活性。在Aβ誘導PC12細胞損傷的模型中,核桃仁乙酸乙酯提取物可明顯降低細胞內的ROS水平,增加Aβ損傷組的細胞活力,提示核桃多酚對損傷細胞的保護作用機制可能與抑制誘導劑介導的ROS產生有關[25]。且Yang等[26]發現核桃多酚通過影響自由基、抗氧化酶及脂質過氧化代謝產物來增加小鼠脾淋巴細胞的免疫功能。研究發現在用小鼠頸背皮下注5% D-半乳糖來建立的衰老模型中,核桃仁丙酮提取物能顯著提高腦組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶的活性,同時能明顯減少腦組織中過氧化脂質的形成,具有良好的抗氧化和抗衰老作用[27]。

上述實驗從體內體外較為全面的分析了核桃多酚的抗氧化活性,也表明了核桃多酚具有優異的抗氧化性。但從核桃多酚對人體的價值角度而言,體內和體外細胞實驗都基于模式動物小鼠和體外培養的人體細胞進行,未能準確模擬人體的真實環境,明確核桃多酚在人體內的存在形式和作用方式。如果在現有的理論基礎上,進一步設計出能真實模擬人體環境的實驗進行研究,不失為一件有意義的舉措。

2.2 神經保護作用

核桃自古以來就是健腦益智的佳品,現代營養學與藥理學研究表明核桃對腦老化具有很好的保護作用,增加核桃攝食對AD等神經退行性疾病具有良好的防治作用[28-29]。近年來,大量研究表明核桃多酚在核桃健腦益智功效中可能發揮重要作用。研究發現核桃仁多酚提取物對H2O2(200 μmol/L)和Aβ1-42(75 μmol/L)誘導的PC12細胞損傷具有顯著的保護作用[30-31]。在用脂多糖誘導炎癥反應的BV2細胞模型中發現核桃多酚提取物具有良好的抗炎及細胞保護作用[32]。這些損傷因素被認為是AD發生的重要誘因。陳超等[33]用CoCl2處理SH-SY5Y細胞模擬細胞缺氧損傷模型,發現核桃多酚提取物對損傷的SH-SY5Y細胞有一定的保護作用。提示核桃多酚對Aβ毒性蛋白、炎癥及缺氧損傷等條件引起的神經細胞損傷均具有保護作用。此外,在體內動物模型上,周麗莎等[34]發現核桃仁的丙酮提取物具有較好的防治AD的作用,其作用機理可以與AD模型小鼠腦內的乙酰膽堿、乙酰膽堿轉移酶和乙酰膽堿酯酶活性提高有關。Haider等[35]研究發現核桃浸提液能明顯改善經東莨菪堿誘導大鼠的記憶障礙和氧化應激水平。付艾妮等[36]用Meynert基底核注射Aβ1-40建立AD模型大鼠,對造模成功后的大鼠分組,分別灌胃給予核桃仁丙酮提取物、乙醇提取物、水提取物,灌胃劑量為3 g/kg,以Morris水迷宮評價大鼠學習記憶能力,用透射電鏡觀察神經元超微結構,結果顯示核桃仁丙酮提取物具有較好防治AD的作用。上述實驗從體外細胞水平和體內動物水平上表明了核桃多酚具有良好的預防AD的作用,其作用機理可能與自由基誘導的氧化損傷的保護作用、抗炎作用和提高體內乙酰膽堿酯酶活性有關。雖然目前核桃多酚從多方面都表現出神經保護作用,但多限于體外培養的人體細胞和動物模型的研究上,作用機理也尚未深入到具體靶點的研究,所以對核桃多酚預防AD等神經保護作用的研究還存在很大的研究空間。

2.3 降血脂作用的研究

研究表明,核桃多酚化合物對心血管疾病有潛在的防治作用,主要體現在降低血脂作用上。陸柏益[37]等人研究發現核桃甾醇提取物能明顯的降低大鼠體內甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)的含量,可用于制備降血脂的藥物。且核桃仁多酚能有效的抑制血漿中的低密度脂蛋白的氧化,對預防動脈粥樣硬化和改善血脂絮亂有很好的作用[23]。而且核桃餅粕多酚純化物還可通過降低谷氨酸鈉誘導的肥胖小鼠的體重、Lee’s指數、脂肪指數、血清TG、TC、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平和提高HDL-C和脂聯素水平,來改善小鼠體內的血脂紊亂[38]。研究還發現核桃仁多酚通過增強肝臟中過氧化物酶體脂肪酸β氧化來降低小鼠體內甘油三酯水平,有效的改善高脂血癥[39]。核桃多酚能顯著降低體內血中的膽固醇、甘油三酯的含量和LDL-C水平是其降血脂的主要機理。

2.4 降血糖作用的研究

目前研究表明,核桃仁和核桃葉多酚能有效的降低血糖,在降血糖天然藥物成分的研發中具有重要意義。付田等[40]研究發現核桃仁乙醇提取物具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,對糖尿病有一定的防治作用。還發現核桃餅粕多酚純化物顯著降低肥胖小鼠的血糖水平,有效改善谷氨酸鈉誘導的肥胖小鼠糖代謝紊亂[38]。在與正常動物的對比中,陳琳[41]等發現山核桃葉總黃酮苷元對四氧嘧啶誘導的高血糖動物可明顯的降低血糖及血清果糖胺水平,并增加小鼠體質量,而對正常動物血糖和體質量基本無影響。從體內外實驗中核桃多酚的降糖效果基本得到證實,其作用機理主要集中在抑制腸道內相關酶類的活性上。但對于核桃多酚的降糖機制的研究相對較少,有待于進一步從藥物動力學、分子生物學水平進行深入的研究。

2.5 抗癌作用的研究

近年來,核桃多酚對腫瘤細胞的抑制作用引起了人們極大的興趣,使其逐漸成為該領域的研究熱點,其機制可能涉及抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡及細胞因子的產生等,目前研究主要集中在核桃仁、核桃殼及核桃青皮多酚的抗腫瘤效應。司傳領等[42]以柔紅霉素為對照,發現核桃青皮單寧對急性淋巴母細胞白血病T(Molt-4 細胞)具有顯著的抑制作用。Anderson等[43]研究發現核桃仁多酚和純化鞣花酸可通過抑制腫瘤細胞的增殖和細胞因子的產生來達到抗癌的作用。有學者發現,核桃多酚提取物抗癌活性強弱與癌癥種類有關。在對核桃仁、核桃殼和核桃葉提取物的抗癌研究中發現研究發現,核桃仁提取物對腎癌細胞的抑制效果最好,而核桃葉提取物則對結腸癌細胞抑制效果最強[44]。從上述實驗可以看出核桃多酚對腎癌和結腸癌等多種癌細胞有很好的抑制作用。

2.6 抗菌作用的研究

Pereira等[45]研究表明了核桃葉酚類化合物對革蘭氏陽性菌和芽孢桿菌具有很好的抑制作用。張琴[46]研究發現核桃葉水浸提液對棉花枯萎病菌菌絲的生長有一定的抑制作用,且存在明顯劑量效應關系。不同部位的核桃多酚抑菌能力有一定差異,研究發現核桃青皮總黃酮的抑菌效果較核桃葉總黃酮的抑制效果顯著[47]。目前,核桃多酚的抑菌作用主要是核桃葉和青皮來源多酚,但其作用機理尚不明確,有待進一步深入研究。

3 總結與展望

綜上所述,目前對核桃多酚的化學及生物活性都開展了大量的研究工作,核桃中含有豐富的多酚類物質,賦予其優異的生物活性,其中核桃青皮多酚抗癌和抗菌效果顯著,核桃葉具有良好的抗氧化和抗菌效果,而核桃仁的抗氧化、神經保護、降脂、降糖等生物活性突出。核桃多酚所含化學成分是是開發利用其生物活性的前提,當前核桃多酚與其它植物多酚的成分差異尚還不明確,如核桃多酚與且其生物活性多數還停留在對各部位粗提物的研究,因此核桃多酚的化學成分和生物活性研究還不夠系統,細分核桃多酚的功效成分及其活性機理,研究其構效關系等需要我們進一步去完善。