高密度發酵乳酸菌抗凍性影響因素分析

嚴濤，朱建國，姜甜，陳珂可，方曙光

（江蘇微康生物科技有限公司 江蘇蘇州 215200）

乳酸菌作為益生菌種類之一，其益生功效被廣泛應用于保健食品、醫藥和食品等行業中。其生產工藝中真空冷凍干燥是其制備工藝中的主要環節之一，其乳酸菌的抗凍性直接影響凍干粉活菌數水平，其冷凍干燥工藝，甚至前期的高密度乳酸菌發酵工藝條件都會影響乳酸菌的抗凍性[1]，而發酵工藝條件對乳酸菌的抗冷凍性的影響很容易被研究學者所忽視[2]。不同種類的乳酸菌，其抗凍能力大小不盡相同，但是其抗凍過程中的相關機理基本是一致的[3]。本文從發酵過程中的培養基組分、培養溫度、pH值、保護劑、凍干工藝等因素對乳酸菌抗凍性的影響進行分析，為提高乳酸菌的抗凍性，進而提高其凍干粉活菌數水平提供新的思路。

1 高密度乳酸菌發酵工藝對其抗凍性的影響

1.1 培養基的組分及含量對其抗凍性的影響

培養基的組分中碳氮源是主要的影響因素，它們可以對菌體細胞膜中不飽和脂肪酸的含量產生影響，選擇合適的碳源，可以增加細胞膜中不飽和脂肪酸的含量，而其含量的多少與細胞膜的流動性成正比，因此可以提高菌體細胞膜的流動性，使菌體呈現不同程度的抗凍性，使菌體在凍干后的活菌數得到很大提高[4-8]。培養基中的碳氮源除了會影響乳酸菌細膜中的不飽和脂肪酸含量外，不同種類的氮源及碳源還會使乳酸菌的形態發生改變，改變其菌體對周圍環境的抗性。Shao Yuyu 等[9]在常用的乳酸菌（De Man，Rogosa and Sharp，MRS）培養基上，額外添加酵母浸膏，其保加利亞乳桿菌ND02的菌體長度是未添加的2倍，菌體表面積的增加，會增大在冷凍過程中形成的冰晶對菌體細胞膜的機械損傷，進而導致保加利亞乳桿菌大量死亡。不同的碳氮源，會影響乳酸菌的代謝途徑，進而產生不同的代謝產物。而有些代謝產物的積累也會對乳酸菌抗冷凍性產生一定的影響[10]。例如在含有蔗糖或果糖的培養基上生長的腸膜明串珠菌，其代謝產物可產生甘露醇，這種代謝產物可以維持乳酸菌在低水分下的活性，而且還能起到抗氧化的作用[11]；同樣對于海藻糖，當培養基中沒有速效碳源（如葡萄糖）時，其作為培養基成份之一會被乳酸菌作為碳源利用，其代謝產物，如乳酸，反而會使菌體周圍環境pH值降低，影響菌體內外的離子平衡，進而使其死亡率增加[12]。另外研究也發現當乳酸菌在含有某些特定碳水化合物的環境中生長時，其經過代謝產生的胞外多糖也能提高乳酸菌的抗凍性[13]。

在培養基中添加鈣離子時，其鈣離子可與乳酸菌在培養過程中產生的代謝產物乳酸及其它酸進行中和，生成乳酸鈣鹽，減緩pH值下降的程度，降低因過酸對乳酸菌菌體生長造成影響。冷凍干燥過程中，菌體內由液體狀態變為冰晶狀態，菌體細胞膜的流動性降低，其鈣離子的存在可以使不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值增大，而其比值越大，則乳酸菌的抗冷凍能力越強[14]。另外，也有研究發現大部分乳酸菌為厭氧或兼性厭氧菌，對氧自由基比較敏感，而錳離子的存在能與超氧化物歧化酶結合，穩定其酶的結構，保障酶的催化活性，從而提高其低溫不利條件下乳酸菌的活性，對乳酸菌的抗凍性能有一定的促進作用[15]。因此，培養基中添加適當的金屬離子，可增加不飽和脂肪酸的含量，提高乳酸菌抗氧性能，進而提升其菌體的抗凍性。添加適量的吐溫-80可增加乳球菌和乳桿菌菌體細胞膜中的不飽和脂肪酸含量[16]，增加低溫狀態下細胞膜的流動性，從而提高乳酸菌的抗凍性能。如果培養基中同時添加鈣離子與吐溫-80，則更能有效提升其菌體的抗凍性能。

以上研究表明，培養基中不同的氮源、碳源對不同菌抗凍性能影響不同，動物來源的氮源可提升菌體的抗凍性，采用合適的氮源、碳源可使菌體產生可保護菌體的抗凍代謝產物，添加海藻糖，需要考慮其被代謝后產酸對菌體的影響，因此其添加量一定要控制在的合理范圍內。在乳酸菌的培養基營養成份改變過程中，以發酵液活菌數作為最基本的參考指標，同時更重要的是要考慮在該種培養基下培養得到的乳酸菌對其在后期真空冷凍干燥過程中抗凍性的影響，以得到一個即經濟又實用的培養基配方。

1.2 乳酸菌的生長溫度對其抗凍性的影響

乳酸菌在高密度發酵時，其生長溫度的高低也會影響菌體細胞膜脂肪酸的含量，進而對乳酸菌的抗凍性產生影響。大多數乳酸菌在低于最適溫度3℃～5℃時，會提高菌體膜內不飽和脂肪酸C18∶2的含量，其細胞膜的流動性也相應增強，最終提高其抗冷凍能力，但需要把握好溫度的變化，不能過低，否則不利于菌體生長[17]。低溫還會促進某些乳酸菌多糖合成，從而提高其冷凍干燥存活率[18]。在30、35、37℃分別發酵培養嗜酸乳桿菌RD758與CRL640、棒狀乳桿菌Si3及保加利亞乳桿菌L2時，通過比較冷凍前后凍干存活率的情況可知，在30℃發酵培養時其抗凍能力最強，凍干存活率高達67%，相比之前提高30%，而嗜熱鏈球菌在30℃培養所產生的胞外多糖比在37℃的高2倍～5倍，而這種多糖物質對乳酸菌抗凍性有明顯的提升作用[18]。因此，適當降低培養溫度，可改變膜內不飽和脂肪酸的含量，在凍干時有利于提高細胞膜的流動性；同時還能促進乳酸菌的多糖合成，提升乳酸菌的抗凍性。

1.3 發酵過程中恒定pH值對乳酸菌抗凍性的影響

乳酸菌在發酵過程中pH值的控制也會對其抗凍性產生影響。研究發現不同的乳酸菌（球菌、桿菌等）其發酵pH值對抗凍性有明顯區別，研究發現乳球菌在pH值為6.0的發酵培養條件下生長比較適合；而乳桿菌則適合在pH值為5.0的發酵培養條件下生長。主要原因還是不同pH值會增加細胞膜內不飽和脂肪酸的含量，提高菌體細胞膜的流動性，進而提高其抗凍性能[19]；過酸過堿也不利于菌體的生長。另外，也有研究發現[20]不同恒定pH值會對其菌體形態產生影響，保加利亞乳桿菌ND02在發酵培養時，當在恒定pH值由5.7到5.0的普通MRS培養基中生長時，其菌體形態由細長形變成短粗狀，而形態呈短粗狀時，其凍干存活率優于細長形。因此，針對不同的乳酸菌需控制其相適應的發酵pH值，在相應的發酵pH值條件下培養，可影響菌體膜內脂肪酸的含量，改變菌體形態，進而提升其菌體的抗凍能力。

1.4 發酵過程中的中和劑對乳酸菌抗凍性的影響

乳酸菌在發酵過程中，由于其菌體的生長，影響培養基中pH值變化的代謝產物主要以乳酸為主，當然也有其它酸（如乙酸、甲酸等），其過低的pH值會對乳酸菌的生長產生反饋抑制。因此，在發酵過程中需要通過中和劑來中和酸性物質，維持培養基中pH值的恒定，保證其菌體的最佳生長環境。中和劑一般呈堿性，如碳酸鈉、氨水、氫氧化鈉等，使用濃度（質量體積比）一般為20%～30%。由于氨水能游離出NH4+，其容易透過細胞壁，刺激菌體生長，提高發酵液活菌數水平，進而提高凍干后菌粉的活菌數水平，比較適合作為酸堿中和劑[21]；但張興昌等[22]研究嗜熱鏈球菌ND03時，發現采用30%碳酸鈉作為中和劑比25%氨水節約20 mL，而且碳酸鈉作為中和劑，其與酸中和后，會產生CO2，形成厭氧環境，而乳酸菌基本大部分屬于兼性偏厭氧生長，為厭氧乳酸菌的生長創造較適宜的環境。綜上所述，乳酸菌在生長時代謝產生的酸使環境pH值降低，從而影響其生長的最佳環境。在生長過程中，添加適當的酸堿中和劑維持恒定的pH值，更有利于維持乳酸菌的生長最佳環境，進而提高凍干后菌粉活菌數水平。

1.5 乳酸菌菌體的收獲時期對其抗凍性的影響

乳酸菌在發酵過程中，其菌體生長會經過延滯期、對數期、穩定期及衰亡期。不同的菌體收獲期對其活菌數有顯著影響。有研究發現菌體在發酵培養達到穩定期初期后經過離心、乳化、凍干收獲得到的菌體存活率較對數期中期收獲的菌體存活率高8倍[23]。乳酸乳球菌DRC-2與DRC-2C在對數期存活率較低，分別為28.5%和34.7%，而穩定期存活率達到60%和61.2%，提高了 2 倍～3 倍[24]。Rault等[25]在研究時發現保加利亞乳桿菌CFL1在穩定期收獲的菌體其抗冷凍性好于其對數期；Ampatzoglou等[26]在研究鼠李糖乳桿菌LGG時發現在穩定期收獲的菌體其抗凍性要優于對數期；Louesdon等[27]對長雙歧桿菌RO175的研究，也表明穩定時期收獲的菌體經過凍干后，其抗冷凍干燥性能要優于對數期。

之所以在穩定期收獲的菌體其抗凍性要優于對數期，是因為處在穩定期的菌株因為培養條件的改變（低物的累積、pH值的改變等）、營養物質的缺乏，使其菌體生長與死亡處于一種動態平衡狀態，從而誘導菌體產生一系列適應環境的應激反應，提高了其對不良環境的抗性[28]，如穩定期時其細胞膜脂類成分（環丙烷化脂肪酸（cycC19∶0）含量增加）發生改變，從而增強乳酸菌的抗冷凍干燥能力[29-30]。另外在穩定期時，其乳酸菌的應激蛋白的表達水平、細胞壁的結構上也發生了劇烈變化，導致其對冷凍干燥等不利條件的抗性增加[31]。當然也有例外，如袁杰利等[32]分別對處在對數期和穩定期收獲的布氏乳桿菌R1102進行抗冷凍干燥存活試驗時，結果發現二者之間沒有顯著性差異，可能是不同菌株之間發酵培養的差異所造成的[33]。綜上所述，處在穩定生長期的乳酸菌其抗冷凍干燥性能要強于其他生長時期階段，同時也要考慮到菌株間的差異性。

1.6 高密度發酵乳酸菌結束后的處理對其抗凍性的影響

乳酸菌發酵結束后，可通過調整發酵液pH值、添加特定物質等方式來提高其抗凍性。有研究發現將嗜熱鏈球菌ND03發酵終點的pH值由5.8調至6.6，離心、乳化、凍干后所得到的菌體存活率大大提升[34]。張中青等[35]研究發現在發酵結束后的保加利亞乳桿菌ATCC11842的發酵液中添加滅菌過的2%（質量體積比）氯化鈉溶液，37℃，100 r/min條件下培養2 h后，收集菌體與保護劑進行乳化、冷凍干燥后，其凍干存活率達到65%，是未處理的1.43倍。究其原因是氯化鈉的刺激，改變了細胞內輔因子水平，使菌體胞內磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）活性增加了31.4%，提高酶的活性，將冷凍干燥對乳酸菌帶來的損傷降至最低，從而提高乳酸菌的凍干存活率[36]。因此，發酵結束后，通過對發酵pH值的調整，或添加特定物質，有利于提高菌體產酸活力水平，間接提高某些激酶的活性，進而提高菌體的凍干存活率。

2 高密度乳酸菌發酵保護劑/凍干對乳酸菌的抗凍性的影響

2.1 保護劑對乳酸菌的抗凍性的影響

凍干保護劑對乳酸菌的凍干存活率有著直接的影響，因此乳酸菌的菌泥在凍干前與適當的保護劑乳化混合后凍干，可提高乳酸菌的存活率。保護劑的作用效果與其化學結構、分子量大小密切相關。在冷凍干燥和保存中，不同的物質如糖類（蔗糖、乳糖和海藻糖）、蛋白質化合物（脫脂牛奶）、氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）和抗氧化劑（抗壞血酸）已被作為保護劑來提高乳酸菌的存活率[37]。凍干保護劑大致可分為兩種：一是小分子量化合物。如氨基酸類、有機酸、低分子的糖類和糖醇類等，這些小分子物質都能透過乳酸菌的細胞膜進入細胞內抑制冰晶生成、減緩冰晶生長，冷凍時可減少對菌體的傷害；二是大分子物質。如蛋白質、多糖、聚乙烯吡咯烷酮和其他的合成聚合物等[38]，這些大分子物質不能穿透乳酸菌細胞膜，由于其具有較強的親水特性和氫鍵形成能力，其附著在菌體表面，形成穩定的水分子層，阻止細胞膜內結合水向外轉移，保護了菌體細胞結構。不同的保護劑物質種類搭配，可減少冷凍干燥對菌體的損傷，提高菌體的抗凍性，進而對乳酸菌的凍干存活率有顯著提升，在保護劑中，碳水化合物類、氨基酸類、肽和蛋白質類應用的最多。從目前的研究看，對乳酸菌菌體的凍干脫水方面具有顯著保護作用的是碳水化合物類保護劑。其作用機理在于抑制膜脂的相變，即在乳酸菌菌體在凍干升華干燥脫水時，進行“水置換”作用，使得在有碳水化合物保護劑存在的條件下，其干燥膜脂狀態與未脫水前生理特征相似[39]，從而穩定其菌體細胞結構，提高凍干后菌體的存活率；脫脂牛奶中包含一個混合的大分子（乳清蛋白和酪蛋白）和糖類，脫脂牛奶可使凍干產品形成多孔結構，更易再水合；在細胞膜脫水后，這些糖類物質代替了結合水，防止蛋白質通過氫鍵的顯露或集聚[40]，為乳酸菌提供良好的保護，故其可作為許多乳酸菌的保護劑[41]；脫脂乳可以通過穩定細胞膜成分防止細胞損傷，提供了細胞蛋白保護層[42-43]。而各種保護劑搭配使用優于單獨使用，需要將大分子和小分子物質結合起來使用，才能更好的發揮其保護效果。

2.2 預冷凍速率對其抗凍性的影響

在凍干過程中，其凍干工藝，如預冷速率等也會影響菌體的凍干存活率。其中緩慢冷凍可以增加乳酸菌的抗凍性。原因是經過預冷處理的乳酸菌，其菌體受低溫刺激，可誘導其產生冷應激蛋白，提高相關酶的低溫活性；此外，低溫會使菌體細胞膜上的飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉變，增加菌體在低溫下細胞膜的流動性。這些現象對乳酸菌后期的冷凍干燥抗凍性起著重要的積極保護作用[44]。另外，也有研究表明凍干時，其冷凍速率在5℃/min～180℃/min之間時，冷凍干燥時胞內水分會完全滲出菌體外，菌體內不會出現結晶，乳酸菌存活率較高；當冷凍速率在180℃/min～5 000℃/min之間時，菌體內的水分容易在外滲過程中形成結晶，進而容易對菌體造成機械損傷；當冷凍速率大于5 000℃/min時，胞內水分來不及外滲而迅速形成結晶，細胞存活率會受一定的影響；因此在預凍時，需要根據不同菌體的特性來調整其冷凍速率，以達到最佳冷凍存活率[44]。

3 小結

真空冷凍干燥是乳酸桿菌菌粉制備工藝中的重要環節之一，菌體在冷刺激下會發生一系列改變，例如細胞膜的變化、遺傳物質的變化等，本文從發酵工藝、發酵后處理、保護劑及凍干工藝等因素對乳酸菌的抗凍影響進行了分析，其培養基成份、培養基溫度、發酵pH值、保護劑及凍干工藝等因素都會對乳酸菌的凍干性能產生影響，針對不同菌株的特性需要采用不同的控制條件，而且不同因素之間也存在一定的聯系，把握好各個影響因素之間的關系，也是提高乳酸桿菌抗凍性的關鍵之一。目前對乳酸菌的抗凍性的研究停留在宏觀研究水平（如培養基、溫度、pH值等），而微觀水平（菌株代謝、菌體與營養物質的交換、菌株的差異性等）研究的還不夠深入，乳酸菌的抗凍性是一個很復雜的過程，仍需在今后對其進行更進一步深入的研究。