基于高通量測序的超級稻不同生育期土壤細菌?和古菌群落動態變化

吳朝暉，劉清術，孫繼民，周建群，李鴻波，袁隆平*

（1. 湖南雜交水稻研究中心，雜交水稻國家重點實驗室，湖南 長沙 410125；2. 湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；3. 湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009；4. 湖南省土壤肥料研究所，湖南 長沙 410125；5. 湖南省農業信息與工程研究所，湖南 長沙410125）

我國水稻土分布廣泛，面積約占世界水稻土面積的1/4，占我國耕地面積的25%左右[1]。水稻作為最重要的糧食作物，一直被放在優先發展地位。在水稻與土壤系統中，土壤微生物是維系此系統健康與穩定的重要成員。水稻在不同生育期內對養分的需求不同，其生長過程實質是一個土壤—微生物—水稻相互作用的過程[2-3]。水稻及其根系生長代謝活動改變土壤理化性質，土壤性質又影響水稻及其根系的生長代謝，且兩者相互作用調控土壤微生物群落結構和豐度的變化[4]；土壤微生物通過分解非根際土中幾丁質和肽聚糖，再經菌根真菌供給作物吸收利用，從而影響作物生長[5-6]。同時，水稻根系分泌的氧氣可以擴散到根際周圍[7]，促進微生物的氧化過程；水稻根系分泌的有機物可以為異養菌的繁衍提供充足的有機碳源[8-9]。水稻生長旺盛時期由于根系分泌物增加，促進微生物繁衍；同時水稻植株與微生物對養分產生競爭，促使土壤微生物增強胞外酶的分泌，加速對土壤有機質的水解作用，從而為水稻和微生物提供更多的養分和能量[10]。因此，水稻—土壤—微生物相互作用維系著水稻土環境生物生長的營養元素計量學需求[11-13]。以上研究多通過酶學等方法對水稻根系與土壤微生物關系進行探討，而土壤胞外酶的狀況與水稻土壤微生物的種類及其生長狀況有著密切關系，所以對水稻土微生物群落組成狀況的研究具有重要意義。吳朝暉和袁隆平[14]通過培養法對不同施氮水平根際土中微生物數量變化研究顯示超級稻根際微生物數量及活性在不同施肥處理間差異顯著。Zhu等[15]通過磷脂脂肪酸法對7個品種超級稻根際微生物群落結構研究表明超級稻根際土壤微生物群落結構和活性與水稻品種的遺傳背景有關。張振興等[16]通過末端限制性片段長度多態性分子生物技術對水稻分蘗期根際土壤中細菌組成研究發現水稻根系活動和稻田土壤水分狀況是影響細菌生態功能的重要因素。近年來高通量測序技術，以耗時少，通量高，能夠較準確全面反映土壤微生物群落分布特征等優勢，逐漸被用在環境樣品分析中[17]。目前對于超級稻不同生育期土壤微生物群落組成狀況的研究報道較少。

我國水稻育種和栽培技術在國際上取得了很有影響力的成果。半高稈超級雜交稻是袁隆平院士2012年提出來的新概念，其特點是產量優勢明顯，生物量大，具有強大的根系。因此研究高產和低產生態區半高稈超級稻不同生育期土壤微生物的群落組成和豐度特征及微生物變化的主要影響因子，對闡明超級稻高產的適宜土壤環境條件，揭示其高產機制有重要科學意義。本研究以大田條件下半高稈超級雜交稻稻田土壤為研究材料，運用高通量測序技術，分析高產生態區和低產生態區高產條件下超級稻不同生育期對土壤微生物群落結構、多樣性與豐度的影響，揭示半高稈超級雜交稻不同生育期土壤微生物動態變化及其影響因素，為探究超級稻高產機制提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與供試材料

試驗區位于湖南水稻高產區（HLW）隆回王化永村（110°56′E，27°27′N）和低產區（LNX）寧鄉（112°16′E，28°08′N），土壤類型為潮土，栽種前土壤耕作層（0～20 cm）的基本理化性狀見表1。供試水稻品種為超級稻“Y兩優900”，由湖南雜交水稻研究中心提供。2014年5月移栽，10月收獲，水肥等栽培條件和管理措施按常規進行。其中隆回試驗區于5月1日施基肥鮮雞糞6 000 kg/hm2，復合肥750 kg/hm2；5月14日追施尿素135 kg/hm2，復合肥112.5 kg/hm2；5月22日追施尿素75 kg/hm2，氯化鉀112.5 kg/hm2；7月5日追施尿素60 kg/hm2，氯化鉀150 kg/hm2，分別于8月8日和16日噴施0.5%氨基酸葉面肥1 800 L/hm2。寧鄉試驗區于5月25施基肥過磷酸鈣600 kg/hm2，氯化鉀90 kg/hm2，復合肥450 kg/hm2，6月5日追施尿素120 kg/hm2，6月15日追施尿素90 kg/hm2，氯化鉀150 kg/hm2，復合肥225 kg/hm2，7月20日追施尿素60 kg/hm2，氯化鉀135 kg/hm2，復合肥75 kg/hm2，分別于8月8日和16日噴施0.5%氨基酸葉面肥1 800 L/hm2。

表1 不同產區土壤化學性質Table 1 Chemical properties of the soils in different areas

1.2 樣品采集

分別于超級稻移栽前（4月29日）、分蘗期（6月14日）、抽穗期（8月15日）和成熟期（9月24日），按“S”形采集表層0～20 cm土壤樣品，每個重復區取10～15個點混合，混合后的樣品立即分成2份，一份包入無菌錫箔紙放入液氮中速凍，帶回實驗室后保存在-80 ℃冰箱中用于微生物群落分析，另一份裝入封口聚乙烯袋，帶回風干處理，用于理化指標分析。每個生態區采集3個重復樣品。

1.3 樣品測定與分析

pH用酸度計法測定（土水比1∶2.5）；全氮用凱氏定氮法測定；有效磷用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定；速效鉀用乙酸銨浸提—原子吸收火焰光度法測定；有機質用重鉻酸鉀容量法測定[18]。

土壤微生物基因組 DNA 采用MOBIO土壤微生物提取試劑盒（PowerSoil?DNA Isolation kit）進行提取，提取的DNA采用NanoDrop分光光度計（Thermo Fisher）進行質量和濃度檢測。

以提取的土壤微生物基因組DNA為模板，采用16S rDNA通用引物515F（5’-GTGCCAGCMGCC GCGGTAA-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3’）擴增細菌和古菌的16S rRNA V4高變區，擴增體系和條件參考Caporaso等[19]的研究，然后對PCR擴增產物進行純化，并將純化產物送至中南大學資源加工與生物工程學院采用Illumina MiSeq測序平臺進行高通量測序。

1.4 數據處理

對所得測序結果進行加工和去雜（使用軟件FLSAH），去除前后引物，獲得首尾整齊的高質量序列，然后用軟件Mothur（http://www.mothur.org/wiki/Download_mothur）對這些序列數據進行生物信息學分析，以97%相似性劃分OTU（Operational Taxonomic Unit），并采用RDP classifier貝葉斯算法對各OTU代表的序列進行分類學分析（Release 11.1, http://rdp.cme.msu.edu/），從而獲得細菌和古菌組成和多樣性數據。采用SPSS19.0雙尾ANOVA分析，以及CANOCO4.5進行RDA冗余分析，以獲取細菌和古菌群落結構與土壤理化性質的耦合關系。

2 結果與分析

2.1 土壤基本理化性質

從超級稻栽種前土壤理化性質分析看，高產區（隆回）土壤偏堿性（7.23），低產區（寧鄉）土壤偏酸性（5.50）；高產區養分全量均大于低產區，其中有機質和全氮的差異均達到顯著水平（P＜0.05），全磷、全鉀無顯著差異（P＞0.05）（表1）。土壤速效養分含量在兩個產區均隨著超級稻生育期的變化有下降的趨勢，其中堿解氮下降最明顯，速效鉀在兩個產區均沒有顯著變化，速效磷只在高產區有顯著變化趨勢（表2）。

2.2 超級稻不同生育期土壤細菌和古菌群落高通量文庫分析

通過對微生物16S rRNA的V4區進行高通量測序，本研究中高產生態區和低產生態區24個樣品共獲得383 286條有效序列，其中細菌序列占91.7%～98.9%，古菌占1.1%～8.3%。以97%相似水平為劃分依據，高產和低產生態區各時期獲得3 243～4 154個OTU（表3），高產區水稻移栽前OTU數量顯著低于生育期（P＜0.05），而低產區水稻移栽前和生育期微生物OTU數量沒有顯著變化（P＞0.05）；高產生態區微生物OTU數量大于低產區，在分蘗期和抽穗期達到顯著水平（P＜0.05）。

三種多樣性指數分析顯示，生育期土壤中微生物多樣性大于移栽前，其中低產田各時期微生物多樣性差異不顯著（表4），Chao指數顯示高產區微生物多樣性在生育期顯著大于移栽前期（P＜0.05）。

高產區微生物多樣性大于低產區，其中Chao指數分析顯示在分蘗期和抽穗期達到顯著水平（P＜0.05），Shannon指數顯示在分蘗期、抽穗期和成熟期均達到顯著水平（P＜0.05），Simpson 指數在4個時期均達顯著水平（P＜0.05）。

表2 土壤速效養分隨超級稻生育期的變化Table 2 Dynamics of soil available nutrients during the super rice cultivation stages

表3 土壤細菌和古菌群落高通量測序文庫質量分析Table 3 Information of high-throughput DNA sequencing libraries of bacterial and archaeal communities in the tested soils

2.3 超級稻不同生育期土壤細菌和古菌群落結構動態分析

本研究獲得的微生物序列可分為28～32個門，73～81個綱，101～120個目，160～211個科，251～399個屬。2.3.1 超級稻不同生育期細菌群落結構與豐度分析根據相對豐度在0.1%以下的為稀有微生物的劃分標準[20]，將各樣品中相對豐度均小于0.1%的菌門舍去。所有樣品中，變形菌門（Proteobacteria，16.65%～38.92%）、酸桿菌門（Acidobacteria，12.61%～19.77%）、綠彎菌門（Chloro fl exi，4.98%～28.26%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，2.90%～8.84%）所占比例最多，為2種生態區表層（0～20 cm）水稻土中主要細菌類群；擬桿菌門（Bacteroidetes，4.98%～9.45%）只是高產區的優勢細菌類群。樣品中檢測到的細菌還有浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes)、放 線 菌 門（Actinobacteria）、 芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes）、 藍 細 菌（Cyanobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospira）、綠菌門（Chlorobi）等。

優勢菌群中，Chloro fl exi在低產區相對豐度顯著大于高產區（P＜0.05），Bacteroidetes和Proteobacteria的相對豐度則是在高產區顯著大于低產區（P＜0.05），Acidobacteria和Verrucomicrobia的相對豐度在2種生產區差異不顯著（P＞0.05）（圖1和圖2）。其它菌群中，Planctomycetes、Actinobacteria和Nitrospira在高產區相對豐度大于低產區，Firmicutes的相對豐度在高產區和低產區差異不顯著（P＞0.05）。

表4 超級稻不同生育期土壤細菌和真菌群落多樣性Table 4 Diversity of soil bacterial and archaeal communities in different growth stages of super hybrid rice

Acidobacteria和Verrucomicrobia的相對豐度在2種生產區隨生育期的變化呈先減小后增大的趨勢，在收獲期相對豐度最大，并且在低產區變化更明顯（圖2）。Bacteroidetes和Proteobacteria的相對豐度在高產區隨超級稻生育期的變化呈現下降趨勢，在低產區總體上也呈下降趨勢，只在抽穗期有一定升高。Chloro fl exi的相對豐度在2種生產區均呈現先上升后降低的趨勢（圖2）。另外，Actinobacteria和Planctomycetes的相對豐度在2種生產區也呈現先上升后降低的趨勢（圖1）。

圖1 超級稻不同生育期門分類水平上土壤細菌群落結構Fig. 1 Soil bacterial community structure at phylum level in different growth stages of super hybrid rice

圖3 不同生育期門分類水平上古菌群落組成Fig. 3 Soil archaeal community structure at phylum level in different growth stages

2.3.2 超級稻不同生育期土壤古菌群落結構與豐度分析 土壤古菌在門分類水平上的群落結構表明，高產區稻田表層土壤（0～20 cm）的主要優勢菌群是廣古菌門（Euryarchaeota），占該區古菌總量的70.1%～84.2%；而低產區稻田表層土壤中的優勢菌群是泉古菌門（Crenarchaeota），占該區古菌總量的38.0%～62.7%，其次是廣古菌門，占30.7%～56.2%（圖3）。

低產區古菌數量顯著大于高產區，是高產區的2.8～5.5倍（圖3）；并且低產區泉古菌門豐度顯著大于高產區，是高產區的7.1～23.0倍。總體上，各優勢古菌門豐度在超級稻生長期呈現先減少后增加的趨勢（圖4）。泉古菌門（Crenarchaeota）豐度在高產區整個生育期無顯著變化（P＞0.05）；在低產區，分蘗期豐度顯著降低（P＜0.05），抽穗期急劇增加（P＜0.01），收獲期略有下降，但不顯著（P＞0.05）。廣古菌門（Euryarchaeota）在高產區和低產區的變化趨勢比較一致，均是分蘗期豐度下降，之后呈現增長趨勢（圖4）。

圖4 門水平上優勢古菌在不同生育期的動態變化Fig. 4 Dynamics of the abundance of main archaea at phylum level during different growth stages

2.4 超級稻不同生育期土壤微生物群落組成的影響因素

通過方差分析顯示，超級稻耕作土壤中微生物多樣性與不同生產區和不同超級稻生育時期均存在顯著相關性（表5）。

表5 不同產區和生育期土壤微生物群落結構差異性分析（雙尾方差分析）Table 5 Relationships between microbial community diversity and area or stages by two-way ANOVA

通過冗余分析法（RDA）對不同產區超級稻不同生育期土壤理化性質與微生物在門水平上的關系進行分析（圖5）。基于這個模型，兩個排序軸共解釋了細菌和古菌菌群的94.3%的變異，其中第一排序軸解釋了80.7%的變異，而第二排序軸解釋了13.6%的變異。第一軸排序軸主要與速效鉀、全氮、速效磷、pH、全磷、有機質、速效氮高度相關，相關系數分別為 -0.951，-0.9468，-0.942，-0.931，-0.871，-0.828和 -0.804。Bacteroidetes、Proteobacteria、 和Nitrospira與速效鉀、全氮、速效磷、pH、全磷、有機質及速效氮正相關。對Bacteroidetes種群影響最大因素的是速效磷，對Proteobacteria影響最大的因素是有機質。優勢菌Acidobacteria與全鉀含量有一定正相關性，而受其它土壤理化性質影響較小，優勢菌Verrucomicrobia與土壤理化性質相關性也較小。Crenarchaeota、Euryarchaeota、Cyanobacteria和優勢菌Chloro fl exi與速效鉀、全氮、速效磷、pH等理化性狀呈負相關關系。

通過RDA分別對兩個不同產區微生物群落影響因素分析表明，高產區微生物群落組成的主要影響因子是速效氮（0.980），其次是速效磷（0.945），然后是速效鉀（0.894）。而低產區的主要影響因子是速效磷（0.896）（圖6）。

圖5 不同生育期土壤性質與細菌和古菌群落的RDA分析Fig. 5 Relationships between microbial (bacteria andarchaea) community and soil physiochemical characteristics based on redundancy analysis (RDA) in four growth stages

3 討論

高通量測序技術以其數據產出通量高的特點在土壤微生物物種多樣性方面得到廣泛應用[17]，本研究利用此技術獲得較好的微生物數量（圖1）。多樣性指數分析顯示高產區微生物多樣性大于低產區（表4），這可能是高產區養分含量有機質、全氮等顯著高于低產區所致（表1）。秦杰等[21]研究發現，有機質含量高的NPK處理土壤細菌和古菌的多樣性顯著高于有機質含量低的CK和PK處理，原因可能是有機質含量低的土壤中細菌和古菌可利用的有機碳源減少。本研究也發現，超級稻生育期土壤微生物多樣性大于移栽前，可能是生育期存在水稻根系分泌的有機物促進了微生物繁衍；Henriksen和Breland[22]、Meidute等[23]發現碳氮底物的可獲性和種類是微生物繁殖的重要控制因素，在水稻根系比較發達的分蘗期和抽穗期，高產區與低產區微生物多樣性差異已達到顯著水平也間接說明可利用碳氮源對微生物多樣性有影響（表1，高產區速效氮含量顯著大于低產區）。Singh等[4]和張振興等[16]研究結果顯示土壤理化性質影響水稻根系的生理代謝，水稻根系的生長代謝活動改變土壤理化性狀，兩者相互作用共同影響微生物的群落組成及多樣性。本研究方差分析顯示土壤中微生物多樣性與不同產區（理化性狀不同）和不同生育期（根系生長代謝差異）均存在顯著相關性，也印證了土壤—植物—微生物間的關系。

圖6 高產區和低產區土壤速效養分與細菌和古菌群落的RDA分析Fig. 6 Relationships between microbial (bacteria and archaea) community and soil available nutrients in high-yield area and low-yield area based on redundancy analysis (RDA).

有研究表明，土壤養分含量不同，使土壤優勢細菌各門、綱的相對豐度不同，土壤營養元素含量的變化導致土壤微生物組成及群落結構發生變化[24-26]。本研究顯示優勢細菌在兩個產區的分布存在差異，Bacteroidetes和Proteobacteria的相對豐度在高產區顯著大于低產區，而Chloro fl exi在低產區相對豐度顯著大于高產區。從RDA分析可見，土壤速效磷含量是影響Bacteroidetes豐度的最主要因子，Proteobacteria也與土壤有機質和速效氮高度正相關，而Chloro fl exi與土壤養分呈負相關，這可能是這3類優勢菌在兩個產區形成差異的主要原因。其它常見菌群中，Planctomycetes、Actinobacteria和Nitrospira在高產區相對豐度大于低產區，可能受土壤堿解氮和有機質的影響（圖6）；其中參與硝化作用的硝化螺旋菌門Nitrospira受土壤速效氮素影響最大。如已有研究報道，古菌耐受性較強，適宜在養分含量較低的環境中生長[27-29]，本研究得出類似結論，低產區古菌數量顯著大于高產區，RDA分析發現古菌與土壤養分含量，特別是速效氮和有機質呈負相關關系。通過分析微生物組成與土壤養分含量關系，可以得出Bacteroidetes、Proteobacteria、Planctomycetes、Actinobacteria和Nitrospira喜好營養豐富的土壤環境，Chloro fl exi、Crenarchaeota和Euryarchaeota在較低營養環境中生長更好。

大量研究表明土壤微生物群落組成與土壤pH密切相關[30-34]。陳孟立等[24]和Liu等[25]研究報道Proteobacteria為堿性土壤中的主要優勢菌群，本研究雖顯示在堿性水稻土中其豐度顯著大于偏酸性水稻土，但最大影響因素是土壤有機質和速效氮含量，差異存在原因可能是前者研究對象是旱地土壤環境，本研究是水稻土環境。有研究發現Acidobacteria的數量與組成受pH的影響較大[35-37]，而本研究顯示pH對Acidobacteria的影響不大，并且與土壤養分含量的關系也不大，這與袁紅朝等[38]和Pankratov等[39]研究結果不一致。

在門分類水平上，高產區和低產區在超級稻不同生育期微生物組成存在差異。Acidobacteria和Verrucomicrobia的相對豐度在2種生產區隨生育期的變化呈先減小后增大的趨勢，其變化趨勢與超級稻根系生長趨勢[40-41]相反。Chloro fl exi、Actinobacteria和Planctomycetes的相對豐度在2種生產區均呈現先上升后降低的趨勢，與超級稻根系生長趨勢相近，其可能受水稻根系影響更大。Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度呈現下降趨勢，與土壤速效養分氮磷鉀含量變化趨勢一致，且具有極顯著相關性（表6）；從相關系數大小來看，速效磷是影響此兩種菌門的首要肥力因子，其次是速效鉀。

表6 超級稻不同生育期Proteobacteria和Bacteroidetes與土壤速效養分的相關性分析（n=8）Table 6 Correlation coefficients between soil available nutrient and the relative abundances of Proteobacteria and Bacteroidetes in four growth stages

通過RDA分別對兩個不同產區微生物群落影響因素分析表明（圖6），高產區微生物群落組成的主要影響因子是速效氮，而低產區的主要影響因子是速效磷。這可能因高產區土壤碳氮含量較高（表1），速效氮和速效鉀均處于極豐富狀態，速效磷含量也較豐富[42]（表2），說明在土壤肥力較高水稻土中，速效氮是影響微生物群落的首要限制因子。低產區雖然速效氮處于較豐富狀態，但是速效磷和速效鉀處于較缺乏狀態（表2），所以在養分含量較貧乏水稻土中，速效磷是影響微生物群落組成的主要因子。

4 結論

研究表明，高產區和低產區土壤微生物群落動態變化的主控因子分別是速效氮和速效磷，說明在土壤肥力較高水稻土中，速效氮是影響微生物群落的首要限制因子，而在養分含量較低水稻土中，速效磷是影響微生物群落組成的主要因子。不同產區中土壤有機質是影響Proteobacteria分布的最關鍵因子，土壤速效磷則是影響Bacteroidetes分布的主要因子，而Acidobacteria與土壤養分含量的關系并不大，說明優勢菌群的分布對土壤性質的響應不同。超級稻土壤中微生物多樣性與不同產區（理化性狀不同）和不同生育期（根系生長代謝差異）均存在顯著相關性，印證了土壤—植物—微生物間存在相互作用關系。這些結論為進一步探明超級稻高產的土壤環境微生物分子機理提供數據支持。

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