母鼠長期低劑量錳染毒對子代大鼠睪丸氧化應激狀態及生精細胞凋亡的影響*

王乾興，于明明，張先平

（1.遵義醫學院 細胞生物學教研室，貴州 遵義 563003；2.湖南省婁底市中心醫院生殖醫學中心，湖南 婁底 422907）

男性不育是臨床上常見疾病之一。由于環境污染、不良生活習慣等的影響，男性精子數、精子活動率或正常精子率等均呈下降趨勢[1-3]，已經引起學界的廣泛關注。

環境錳暴露是引發男性生殖障礙的一個重要因素。作為環境中廣泛存在的重金屬，錳在采礦、干電池生產、無鉛汽油以及殺蟲劑等方面的廣泛使用加大了錳污染的程度，提高人類的錳暴露水平。而過量錳的蓄積則可產生生殖毒理作用。研究表明，錳可通過血睪屏障而蓄積于睪丸，引起男性精液濃度、精子活力、精子活率及精子總數降低，雞、大鼠生精細胞凋亡等一系列生殖毒性[4-7]。但上述關于動物實驗的研究大多為急性或亞急性錳染毒，對于慢性染毒后對雄性子代的生殖毒理效應尚未見報道。

錳的毒性機制之一是增加體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，發生氧化應激損傷，導致細胞凋亡[8-11]。叉頭蛋白轉錄因子O 3a（forkheadlike protein O 3a，FoxO3a）屬于叉頭框轉錄因子家族（forkhead box，FOX）O亞族成員，是氧化應激中多個信號通路的交匯點，在細胞增殖、細胞周期阻滯、ROS清除和細胞凋亡誘導中發揮重要作用，已成為氧化應激損傷研究的一個熱點[12-15]。錳對子代雄性大鼠的生殖毒性是否也通過該基因起作用，目前也未見報道。

因此本文對母代大鼠進行長期低劑量錳染毒，探索其對子代大鼠睪丸氧化應激狀態、FOXO3a表達及生精細胞凋亡的影響，明確長期低劑量錳染毒對子代大鼠生精細胞是否具有損傷作用及其分子機制，為錳中毒的預防和治療、環境錳暴露的安全限量的確定提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組滿月無特定病原體（SPF）級雌性SD大鼠（90～120 g），購于第三軍醫大學醫學實驗動物中心（許可證號：SCXK（渝）2012-0005），隨機分為4個組，即對照組，低、中、高劑量組，每組8只。每天12 h光照，12 h黑暗，溫度（21±1）℃，自由進食和飲水。所做實驗獲得遵義醫學院倫理學委員會批準。

1.1.2 主要試劑MnCl2·4H2O（分析純）（購于中國醫藥集團上海化學試劑公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶 （catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量及ROS水平測定試劑盒（購自南京建成生物工程研究所），原位細胞凋亡檢測試劑盒（購于美國Roche公司），RNAiso Plus（購于日本TaKaRa公司），TransStart Tip Green qPCR Super Mix（購于北京全式金生物技術有限公司），FoxO3a和半胱天冬酶9（cysteinylaspartatespecific protease 9，Caspase-9）兔單抗（購于英國Abcam公司），與Bcl-2相互作用的細胞死亡調節子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）兔單抗（購于美國Cell Signal公司），GAPDH鼠單抗（購于美國Proteintech公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）擴增引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成（見表1）。

表1 qRT-PCR擴增引物序列

1.2 方法

1.2.1 動物模型復制參照文獻[16-17]，雌性SD大鼠適應性飼養1周后，分別注射生理鹽水和2、4和8 mg/kg氯化錳，共計8周，與性成熟期雄性SD大鼠按1∶3合籠交配，于次日8：00見陰栓者視為妊娠第1天，妊娠后分開單獨飼養。雌鼠在妊娠期（3周）和哺乳期（3周）繼續染毒，總染毒時間共計14周。各組動物給藥途徑均采用腹腔注射，1次/d，5 d/周。每3天測大鼠體重以監測妊娠情況和調整MnCl2用量。

1.2.2 標本采集每組隨機取8只12周齡子代雄性大鼠斷頭處死，分離雙側睪丸和附睪。左側睪丸收集于無RNA酶的EP管中用于qRT-PCR和Western blot實驗；右側睪丸用4%多聚甲醛溶液固定用于HE染色、TUNEL和免疫組織化學（免疫組化）實驗。附睪用于精液質量檢測。

1.2.3 精液質量檢測切除附睪尾部，縱向切3個切口，放入盛有2 ml預熱PBS的離心管中，37℃水浴20 min。取50 μl精子懸液光鏡下檢測精子密度、活動率和畸形率。

1.2.4 睪丸組織SOD、CAT和GSH-Px活力、MDA含量和ROS水平檢測準確稱取少量睪丸組織，剪碎，加入生理鹽水，超聲粉碎制備10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液按試劑盒說明書分別測定SOD（WST-1法）、CAT（可見光法）、GSH-Px（二硫代二硝基苯甲酸法）活力、MDA含量（硫代巴比妥酸法）及ROS水平（化學熒光法）。考馬斯亮藍法測定相應組織蛋白含量。

1.2.5 qRT-PCR檢測大鼠睪丸組織FoxO3a、Bim mRNA表達RNAiso Plus提取子代大鼠睪丸總RNA，分光光度計測定OD260/OD230、OD260/OD280進行RNA純度鑒定和濃度測定。取2 μg總RNA進行兩步法逆轉錄反應合成cDNA，反應條件為42℃孵育30 min、85℃滅活5 s、4℃冷卻10 min。按試劑盒說明書進行qRT-PCR，反應體系為20 μl，反應程序為：94℃ 預變性30 s，然后再94℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，共40個循環。以GAPDH為內參，以2-△△Ct值作為目的基因的相對表達量。每個樣品設置3管重復，取3次的平均值計算各基因mRNA的相對表達量。

1.2.6 免疫組化法檢測大鼠生精細胞FoxO3a和Bim蛋白表達大鼠睪丸經4%多甲醛固定24 h后冠狀切面制備石蠟切片（4 μm）。石蠟切片常規脫蠟、水化，入3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗后高壓修復2 min（FoxO3a）或微波中高火修復抗原20 min（Bim），PBS沖洗3次×5 min，正常山羊血清封閉。分別滴加FoxO3a（1∶50）和Bim（1∶100）兔單抗，4℃過夜。PBS沖洗3次×5 min，加生物素標記羊抗兔IgG在37℃反應30 min，PBS沖洗3次×5 min。DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照組。

1.2.7 Western blot檢測大鼠生精細胞FoxO3a和Bim蛋白表達取睪丸組織100 mg加入500 μl RIPA裂解液，同時加入PMSF和蛋白磷酸酶抑制劑（與裂解液的比例為1∶100），4℃下電動勻漿6次×5 s，間隔5 s。2 500 r/min，4℃離心15 min，小心吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白變性后上樣，10%分離膠120 V恒壓電泳后，100 mA恒流轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后分別加入一抗（FoxO3a為1∶5 000，Bim為1∶1 000，GAPDH為1∶4 000），4℃過夜。洗膜后加入HRP標記的二抗，37℃孵育1 h，再次洗膜后，加入ECL發光液發光、顯影、定影。將膠片掃描，用Image Pro Plus軟件分析目的條帶的光密度值，以目的條帶/GAPDH的積分光密度值之比作為目的蛋白相對表達量。

1.2.8 TUNEL檢測生精細胞凋亡大鼠睪丸冠狀面石蠟切片（4 μm）常規脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水。微波350 W加熱3 min進行抗原修復，自然放置冷卻到室溫。0.3%的H2O2-甲醇溶液中封閉10 min，PBS沖洗。滴加50μl TUNEL反應液（包括5 μl末端轉移酶溶液和45 μl標記反應液），37℃濕盒避光溫育1 h。PBS沖洗3次×5 min。加轉化劑POD，37℃反應30 min，PBS沖洗，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察。同時設陰性對照（只加標記反應液）和陽性對照（10 μg/ml的DNAase I預處理）。每張切片隨機選擇10個生精小管，計數凋亡信號陽性的生精細胞數占總生精細胞數的比例，即為凋亡指數（apoptosis index，AI）。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較行單因素方差分析，兩兩比較用Tamhane檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 睪丸組織的形態學變化

對照組睪丸曲細精管管腔大小基本一致、各級生精細胞有序排列于管壁上，著色均勻，管腔內可見大量精子細胞和成熟精子。各錳染毒組睪丸生精小管呈現不同程度的形態學改變。隨著錳染毒劑量的增加，生精細胞層數逐漸減少，各級生精細胞排列紊亂、數量減少或缺如，管腔內成熟的精子數目明顯減少。見圖1。

2.2 長期低劑量錳染毒對子代大鼠精液的影響

各組大鼠精子密度、精子活動率及畸形率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。對照組與低劑量組精子密度、精子活動率和畸形率差異無統計學意義，但中、高劑量組精子密度、精子活動率下降，精子畸形率上升，且隨錳染毒劑量的增加逐步遞進變化（P＜0.05）。見表2。

2.3 睪丸組織抗氧化酶活性、MAD含量和ROS水平的變化

圖1 子代大鼠睪丸組織 （HE×400）

表2 各組大鼠精液質量分析結果 （n =8，±s）

表2 各組大鼠精液質量分析結果 （n =8，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.01；2）與低劑量組比較，P ＜0.01；3）與中劑量組比較，P ＜0.05

組別 精子密度（×106/ml） 精子活動率/% 畸形率/%對照組 115.164±25.421 89.422±4.530 15.874±5.141低劑量組 107.320±10.144 81.651±5.868 20.654±4.350中劑量組 84.227±14.0081）2） 54.163±7.1221）2） 41.076±6.7751）2）高劑量組 53.157±5.4371）2）3） 31.467±9.0251）2）3） 58.465±5.1371）2）3）F值 78.492 46.268 66.427 P值 0.000 0.000 0.000

各組大鼠睪丸SOD、CAT及GSH-Px活性，MDA含量及ROS水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，低劑量組睪丸組織CAT含量降低（P＜0.01），中、高劑量組則3種抗氧化酶活性均降低（P＜0.05）；各錳染毒組比較，SOD、CAT及GSH-Px活性均隨錳染毒劑量的增加而逐漸降低（P＜0.05）。

與對照組比較，各錳染毒組MDA含量和ROS水平均升高（P＜0.05）；各錳染毒組比較，隨錳染毒劑量的增加，MDA含量和ROS水平逐漸升高（P＜0.05）。見表3。

2.4 長期低劑量錳染毒對子代大鼠生精細胞FoxO3a和Bim mRNA及蛋白表達的影響

各組子代大鼠睪丸組織FoxO3a和Bim mRNA表達比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，除低劑量組Bim mRNA外，各錳染毒組FoxO3a和Bim mRNA表達量均增加，且隨錳染毒劑量的增加而增加（P＜0.05）。見表4。

表3 各組大鼠睪丸SOD、CAT和GSH-Px活性，MDA含量及ROS水平比較 （n =8，±s）

表3 各組大鼠睪丸SOD、CAT和GSH-Px活性，MDA含量及ROS水平比較 （n =8，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.01；2）與低劑量組比較，P ＜0.01；3）與中劑量組比較，P ＜0.05

ROS/（熒光強度）對照組 142.325±5.624 9.678±1.143 30.254±5.718 0.647±0.119 210.316±37.578低劑量組 127.653±6.757 7.317±1.8461） 28.779±4.617 0.857±0.2511） 335.674±41.1211）中劑量組 90.208±4.3171）2） 4.332±0.7671）2） 21.320±5.0081）2） 1.726±0.5071）2） 452.746±37.5471）2）高劑量組 71.424±7.6781）2）3） 1.269±0.3171）2）3） 17.447±3.2661）2）3） 2.523±0.4481）2）3） 547.249±41.1071）2）3）F值 94.613 16.487 24.669 36.567 197.347 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別 SOD/（u/mg protein）CAT/（u/mg protein）GSH-Px/（u/mg protein）MDA/（nmol/mg protein）

免疫組化結果顯示，FoxO3A、Bim被染成棕黃色或棕褐色，主要表達于各級生精細胞的細胞質，其染色強度隨錳染毒劑量的增加而增加。見圖2。

各組子代大鼠睪丸組織FoxO3a和Bim蛋白表達比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，各錳染毒組FoxO3A和Bim蛋白表達量均增加（P＜0.05），且均隨錳染毒劑量的增加而增加（P＜0.05）。見圖3。

圖2 子代大鼠生精細胞FOXO3a、Bim和Caspase-9蛋白表達 （SP×400）

表4 子代大鼠睪丸組織FoxO3a、Bim和 Caspase-9 mRNA表達的定量和凋亡指數分析 （n =8，±s）

表4 子代大鼠睪丸組織FoxO3a、Bim和 Caspase-9 mRNA表達的定量和凋亡指數分析 （n =8，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與低劑量組比較，P ＜0.05；3）與中劑量組比較，P ＜0.05

組別 FoxO3a Bim Caspase-9 AI/%對照組 1.0 1.0 1.0 5.72±0.53低劑量組 1.4170±0.2271） 1.250±0.081 1.747±0.0971） 9.052±1.0211）中劑量組 2.253±0.1021）2） 1.997±0.2361）2） 2.497±0.0641）2） 15.870±1.3111）2）高劑量組 3.033±0.1781）2）3） 2.581±0.1701）2）3） 3.297±0.3661）2）3） 19.594±1.1201）2）3）F值 21.363 14.168 24.245 66.467 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 長期低劑量錳染毒對子代大鼠睪丸Caspase-9表達和生精細胞凋亡的影響

各組子代大鼠睪丸組織Caspase-9 mRNA及蛋白表達比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，各錳染毒組睪丸細胞Caspase-9 mRNA和蛋白表達量均升高，且隨錳染毒劑量的增加逐漸增加（P＜0.05）。見表4 和圖3。

圖3 子代大鼠生精細胞FOXO3a、Bim和Caspase-9的蛋白表達

TUNEL結果顯示，各組大鼠均可見生精細胞凋亡，凋亡細胞的細胞核呈棕黃色，主要見于精原細胞、精母細胞和精子細胞。各組子代大鼠生精細胞AI比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。各錳染毒組生精細胞AI均高于對照組（P＜0.05），且隨錳染毒劑量的增加而增加（P＜0.05）。見圖4和表4。

圖4 子代大鼠生精細胞的凋亡 （TUNEL×400）

3 討論

毒理學實驗所采用的錳染毒途徑主要有3條：經呼吸道的霧化劑染毒[18-19]、經消化道的食物或飲水染毒[20-21]、經循環系統的皮下或腹腔注射染毒[22-23]。呼吸道染毒可以較為真實地反映錳塵導致的毒性，但該法需要專門的吸入裝置，操作比較繁瑣；消化道染毒或循環系統染毒則由于染毒后動物的活動度下降而導致其進水進食的減少，可能影響到最終的錳攝入量；以往采用皮下或腹腔注射法進行錳染毒的劑量體重大都在7.5 mg/kg以上，遠遠大于環境或特定場所的錳暴露水平。因此對錳毒性的職業防護指導意義有限。由于皮下注射容易發生滲漏而導致劑量不準，本實驗參照文獻[16-17]的方法，采取較低劑量（2、4、8 mg/kg體重）氯化錳進行腹腔注射，以評價低劑量長期錳染毒對子代雄性大鼠的生精細胞的影響。

ROS是需氧細胞進行正常生化反應的產物，包括O2-、H2O2及HO2·OH等，可參與細胞內多種信號轉導過程。由于ROS具有高氧化性，因此在正常情況下，機體主要由SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶來清除ROS，從而維持細胞內低ROS狀態，起保護細胞的作用。當機體內ROS產生過多或抗氧化酶活性下降，造成機體氧化還原水平失衡時，ROS可啟動脂質過氧化而損傷膜功能和完整性，從而造成氧化應激損傷，啟動細胞凋亡程序[24]，而這也正是錳的毒性機制之一[8-11]。此外，MDA是脂質過氧化反應的主要代謝產物，其含量的高低代表脂質過氧化的強度和速率，是評價機體氧化應激狀態的一個常用指標[25-26]。本實驗發現，長期低劑量錳染毒后，子代大鼠睪丸組織內SOD、CAT和GSHPx的活性均隨錳染毒劑量的增加而逐漸降低，而MDA含量和ROS水平逐漸升高。提示母代大鼠長期低劑量錳染毒后，錳可通過胎盤屏障和血睪屏障進入子代大鼠睪丸內，降低睪丸生精細胞ROS清除能力（和）促進生精細胞線粒體產生ROS，從而增加生精細胞ROS水平，引起其脂質過氧化反應，導致氧化損傷[27]。

作為一種多功能轉錄因子，FOXO3a在細胞周期阻滯、細胞凋亡及細胞自噬等過程中起到關鍵作用[28]。當機體發生氧化應激時，ROS可將FOXO3a磷酸化、乙酰化修飾來調控其功能。目前，關于ROS究竟是促進還是抑制FOXO3a活性目前還存在爭議[29-30]，但至少可以肯定的是當ROS過量產生時，FOXO3a高表達可以促進前凋亡蛋白Bim的表達[31-32]，誘發線粒體外膜通透性增加，引起細胞色素C釋放[33]，進一步激活Caspase-9，引起細胞凋亡[34]。本實驗發現，不同劑量氯化錳染毒后，在mRNA和蛋白質水平FoxO3a的表達均增加，且隨著錳染毒劑量的增加而上升。在mRNA水平上，對照組與低劑量組Bim表達量無差異，但中、高劑量組則升高；而在蛋白水平上，各錳染毒組BIM蛋白表達量均增加，且隨錳染毒劑量的增加而遞增。低劑量組Bim mRNA和蛋白水平表達的不一致性，可能與轉錄和翻譯存在時空間隔有關，也可能是2 mg/kg氯化錳染毒劑量相對較小，對Bim基因表達的誘導作用不足造成。無論如何，上述結果至少可以說明母鼠長期低劑量錳染毒可以增加子代大鼠睪丸生精細胞的氧化應激狀態，誘導FOXO3a，后者進一步誘導BIM的表達，啟動生精細胞凋亡程序。

本研究結果顯示，Caspase-9在mRNA和蛋白水平的表達量在各錳染毒組均升高，且隨錳染毒劑量的增加逐漸增加。同時TUNEL結果和精液質量分析結果也顯示各錳染毒組大鼠AI隨錳染毒劑量的增加而上升，精子密度和活動率下降而畸形率上升。結合HE染色結果顯示的生精小管內生精細胞層數逐漸減少，生精細胞排列紊亂、數量減少的結果。提示長期低劑量錳染毒可以誘導子代大鼠睪丸生精細胞Caspase-9的表達，啟動Caspase級聯信號，最終引起生精細胞的凋亡[34-36]。

綜上所述，長期低劑量錳染毒可導致子代大鼠生精細胞凋亡、睪丸功能障礙，其可能機制是通過抑制抗氧化酶活性和促進ROS產生，誘導FOXO3a和BIM表達，從而導致線粒體內細胞色素c的釋放，啟動Caspase-9信號通路，最終導致生精細胞的凋亡。

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