白藜蘆醇阻斷信號通路對鼻咽癌細胞生長的影響

熊赪，易陽艷

（1.江西省南昌市第一醫院 耳鼻喉科，江西 南昌 330000；2.南昌大學第二附屬醫院 整形美容科，江西 南昌 330000）

核孔復合物細胞（human nuclear pore complex cells，NPC）是一種惡性上皮性腫瘤，具有獨特的種族和地域分布特性[1]。東南亞、中國南部地區、中東和北非為NPC的高發區，年發病率20.0～50.0例/100 000人；在歐洲和美國，NPC的年發病率大約為0.5～2.0例/100 000人，男性的發病率高于女性。全世界每年有大約80 000例新確診的NPC患者，大約50 000例患者因其死亡[2]。白藜蘆醇所具有的多種生理特性對人體有益，而且白藜蘆醇對某些類型的腫瘤細胞具有抗腫瘤作用，但是白藜蘆醇對NPC生長的影響及其相關的分子機制仍不太明了[3]。探討天然產物中的有效成分——白藜蘆醇在NPC中的作用，不僅有助于了解白藜蘆醇在預防惡性腫瘤中的作用，而且還可用于治療NPC。

1 材料與方法

1.1 細胞株

高分化的人NPC細胞株CNE-1（湖北民族學院附屬民大醫院保存）；低分化的人NPC細胞株CNE-2Z（湖北民族學院附屬民大醫院保存）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養CNE-1和CNE-2細胞株保存在5%二氧化碳CO2，37℃條件下，用含10%小牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養液傳代培養，實驗用細胞均處于對數生長期。在細胞培養過程中分別用 0、10、25、50、100及200 μmol/L的白藜蘆醇磷酸鹽緩沖液處理CNE-1細胞和CNE-2細胞，分別于24和48 h收集細胞。

1.2.2 細胞增殖抑制實驗（MTT實驗）取上述培養的對數生長期細胞按每孔5×103于180 μl培養液中接種于96孔板過夜，加入不同濃度的白藜蘆醇，每組設8個平行孔。用藥后分別培養24、48及72 h，每孔加入20 μl噻唑藍（MTT）（5 mg/ml），繼續培養4 h。移去培養液，每孔加100 μl DMSO溶解，待完全溶解后于酶標免疫測定儀測定其吸光度（A）值，測定波長為570 nm，參考波長為450 nm。重復3次。計算細胞增殖抑制率及IC50值，繪制濃度-抑制率曲線。

1.2.3 流式細胞儀檢測用流式細胞儀檢測白藜蘆醇誘導NPC細胞凋亡情況和NPC細胞周期分布變化。分別收集對照以及各種濃度白藜蘆醇處理24 h的細胞，加預冷70%乙醇固定過夜。次日完全去除乙醇后，將細胞重懸于40 μl磷酸-枸櫞酸緩沖液中，用50 μg/ml PI（含 100 μg/ml RNaseA，無 DNase）0.5 ml，4℃避光染色30 min，于流式細胞儀檢測凋亡率。每組均設3個復管，并重復3次。

1.2.4 白藜蘆醇對人NPC細胞生長的影響為了進一步驗證白藜蘆醇對NPC的抗腫瘤作用，在裸鼠體內做CN2Z細胞異體移植瘤實驗，并檢測對照組（10%DMSO處理組）和白藜蘆醇（20 mg/kg，注射1次）處理組裸鼠體內的異種移植瘤體積大小。

用遞增濃度（0、10、25、50及100 μmol/L）的白藜蘆醇作用CNE-2Z細胞24 h后，再用Western blot技術檢測與細胞周期調控有關的數種cyclins（cyclin A、B、D及E和CDK/p34蛋白）的蛋白表達水平。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，預先行方差齊性檢驗，如方差齊時采用LSD-t檢驗，如方差不齊時采用Tamhane's T2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對人NPC細胞凋亡、增殖的影響

以0 μmol/L白藜蘆醇組為陰性對照，濃度為200 μmol/L白藜蘆醇組為陽性對照組。實驗結果顯示，CNE-1細胞增殖中不同濃度白藜蘆醇比較差異有統計學意義（F=13.872，P=0.000），與陰性對照比較，當白藜蘆醇濃度為50、100及200 μmol/L時，差異有統計學意義（P＜0.05）；CNE-2Z細胞增殖中不同濃度白藜蘆醇相比較差異有統計學意義（F=23.547，P=0.000）， 當 白 藜 蘆 醇 濃 度 為 25、50、100及200 μmol/L時，差異有統計學意義（P＜0.05）。當用白藜蘆醇處理24或48 h后，兩種具有不同分化程度NPC細胞株的增殖能力均具有隨著白藜蘆醇濃度的增加而降低的趨勢。用相同濃度的白藜蘆醇處理兩種具有不同分化程度的NPC細胞，隨著白藜蘆醇作用時間的延長（從24～48 h），對NPC細胞增殖的抑制作用均越加明顯（見圖1）。

與同型對照組及空白對照組（0 μmol/L白藜蘆醇處理組）比較，隨著白藜蘆醇劑量的增加，白藜蘆醇處理組CNE-2Z細胞的AnnexinV-FITC單陽性百分率也隨之增高（見圖2）。各組間比較差異有統計學意義（F=21.092，P=0.000）。其中0 μmol/L白藜蘆醇處理組中Annexin V-FITC單陽性CNE-2Z細胞的百分率為（0.2±0.1）%；10 μmol/L白藜蘆醇處理組中Annexin V-FITC單陽性CNE-2Z細胞的百分率為（6.4±0.3）%；25 μmol/L白藜蘆醇處理組中Annexin V-FITC單陽性CNE-2Z細胞的百分率為（11.3±0.9）%；50 μmol/L白藜蘆醇處理組中Annexin V-FITC單陽性CNE-2Z細胞的百分率為（16.7±2.1）%；100 μmol/L白藜蘆醇處理組中Annexin V-FITC單陽性CNE-2Z細胞的百分率為（41.3±5.6）%。同時也觀察0 μmol/L白藜蘆醇處理組中PI單陽性CNE-2Z細胞的百分率為（0.5±0.1）%；10 μmol/L白藜蘆醇處理組中PI單陽性CNE-2Z細胞的百分率為（3.4±0.2）%；25 μmol/L白藜蘆醇處理組中PI單陽性CNE-2Z細胞的百分率為（4.3±0.5）%；50 μmol/L白藜蘆醇處理組中PI單陽性CNE-2Z細胞的百分率為（4.7±0.9）%；100 μmol/L白藜蘆醇處理組中PI單陽性CNE-2Z細胞的百分率為（1.2±0.3%）。

2.2 白藜蘆醇對人NPC細胞細胞周期的影響

3組細胞周期比較差異有統計學意義（F=15.936，P=0.000），且50 μmol/L白藜蘆醇組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，用10 μmol/L白藜蘆醇處理后，CNE-1細胞組的細胞周期分布未顯示變化；然而用50 μmol/L白藜蘆醇處理后，CNE-1細胞組G1-期細胞的百分率有降低，從（72.5±9.4）% 降到（39.1±8.6）%（P＜0.01），S-期細胞的百分率有升高，從（10.1±3.3）%升高到（39.8±7.2）%，（P＜0.01），但G2/M-期細胞的百分率無改變。見圖3。

圖1 白藜蘆醇抑制NPC細胞的增殖

圖2 流式細胞儀分析的代表性直方圖

研究發現，不同濃度的白藜蘆醇均能抑制CNE-2Z細胞中的Cyclin A、B、D、E以及CDK/p34蛋白的表達水平，白藜蘆醇對其抑制能力具有較強的濃度依賴性。與對照組比較，50和100 μmol/L白藜蘆醇處理可抑制該蛋白的表達。見圖4。

2.3 白藜蘆醇對人NPC細胞生長的影響

在使用白藜蘆醇處理的第12和15天，白藜蘆醇處理組裸鼠體內的異種移植瘤體積與對照組比較，有減小，異種移植瘤大小分別從（570.9±43.6）mm3降到（326.3±41.6）mm3，從（682.5±38.4）mm3降到（418.6±53.1）mm3，各組間比較差異有統計學意義（F=32.964，P=0.000）。隨著白藜蘆醇處理時間的延長，白藜蘆醇對裸鼠體內異種移植瘤體積大小的抑制作用愈加明顯，通過與對照組比較，發現在白藜蘆醇處理的第18和21天，異種移植瘤大小持續降低，異種移植瘤體積分別從（785.9±59.2）mm3降到（443.5±58.9）mm3，從（824.4±59.5）mm3降到（496.6±62.4）mm3，各組間比較差異有統計學意義（F=41.218，P=0.000）。該數據表明，白藜蘆醇可降低裸鼠體內異種移植瘤體積的大小，且白藜蘆醇對裸鼠體內異種移植瘤體積大小的影響具有時間依賴性。見圖5、6。

裸鼠體內取出的異種移植瘤的分析。HE染色結果顯示，在對照組的切片中，可以看到較多的細胞成分，且細胞核較大、細胞大小較不均一、細胞排列比較紊亂。與對照組相比較，白藜蘆醇治療后的腫瘤組織內細胞成分減少，而具有更多的膠原結構，細胞大小比較均一且細胞排列比較整齊有序。見圖7。

圖3 白藜蘆醇對人CNE-1細胞的細胞周期進程的影響

圖4 白藜蘆醇對CNE-2Z細胞中與細胞周期進程相關基因的蛋白表達水平的影響

圖5 白藜蘆處理3周后，腫瘤生長具有代表性的圖片

圖6 白藜蘆醇對裸鼠中NPC 移植瘤的影響

圖7 裸鼠體內異體移植瘤切片 （HE×400）

3 討論

白藜蘆醇是存在于多種食用、藥用植物中的一種多酚類化合物，近年發現白藜蘆醇有抗癌活性，對癌的起始、促進和發展3個階段均起作用[4]。在對其抗癌機制的研究中發現，白藜蘆醇可通過誘導腫瘤細胞凋亡來抑制其增殖，從而達到抗癌目的，目前對白藜蘆醇的抗癌作用研究也有大量的報道[5]。高倩等[6]發現，白藜蘆醇可劑量和時間依賴性地抑制肝細胞瘤細胞株H22生長增殖，其IC50值為6.75 mg/L，用普通顯微鏡和電子顯微鏡觀察均發現藥物處理組出現典型凋亡小體，因而白藜蘆醇可經凋亡途徑抑制H22細胞生長增殖。WITTE等用白藜蘆醇處理人前列腺癌細胞株DU145通過核小體含量檢測證實有凋亡發生[7]。

本研究中通過對白藜蘆醇阻斷信號通路對鼻咽癌細胞生長的影響，結果與文獻報道基本一致，顯示白藜蘆醇對鼻咽癌細胞的生長有抑制作用[8-9]。在對白藜蘆醇對人NPC細胞凋亡、增殖影響的體外研究時，當用白藜蘆醇處理24或48 h后，兩種具有不同分化程度的NPC細胞株的增殖能力均具有隨著白藜蘆醇濃度的增加而降低。用相同濃度的白藜蘆醇處理兩種具有不同分化程度的NPC細胞后，隨著白藜蘆醇作用時間的延長（從24～48 h），其對兩種NPC細胞增殖的抑制作用越加明顯[10-11]。在白藜蘆醇對人NPC細胞細胞周期影響的體外研究中顯示，白藜蘆醇對人NPC細胞的細胞周期進程的影響，并揭示出可能通過下調各種Cyclins和CDKs的表達而影響NPC細胞周期進程[12]。本研究還證實，白藜蘆醇可降低裸鼠體內異種移植瘤體積的大小，且白藜蘆醇對裸鼠體內異種移植瘤體積大小的影響具有時間依賴性[13]。

綜上所述：①白藜蘆醇不僅以時間和劑量依賴的方式降低NPC細胞的增殖，還可的方式增加NPC細胞的凋亡；②體外研究結果表明，白藜蘆醇可能是通過干擾Akt/p70S6K信號通路而發揮有效的抗增殖和促凋亡作用；③裸鼠CNE-2Z細胞異種移植瘤模型的研究結果表明，白藜蘆醇可抑制NPC移植瘤的生長；④白藜蘆醇有望成為防治人NPC的有效藥物。

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