基于熒光差異雙向電泳的雷帕霉素損傷人冠狀動脈內皮細胞的蛋白質組學研究*

劉少軍，胡坤華，鐘 赟△

(1.廣州醫科大學附屬第二醫院心內科/廣州心血管疾病研究所，廣州 510260；2.中山大學中山醫學院，廣州 510089)

介入治療正日益成為冠心病的首選治療方式[1]，安裝藥物洗脫支架是目前介入治療的常規手段。臨床上發現雷帕霉素在冠心病的治療應用中具有雙重性：一方面抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，有效防止了介入術后的再狹窄；另一方面雷帕霉素抑制內皮細胞增殖和遷移，誘導內皮細胞損傷[2-3]。雷帕霉素延緩支架被正常內皮細胞覆蓋包裹，增加血栓風險，影響遠期療效。雷帕霉素洗脫支架植入相關的支架內血栓，成為介入術后患者重要的致死、致殘因素[2-4]。明確雷帕霉素誘導內皮細胞受損的具體分子機制是克服其不良反應的關鍵。本研究采用蛋白質組學作為篩選手段，系統探索雷帕霉素損傷血管內皮細胞作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 雷帕霉素、硫脲、賴氨酸、二甲基甲酰胺等購自美國Sigma公司;CHAPS、甘氨酸、尿素、低熔點瓊脂糖、蛋白質純化試劑盒Clean-up Kit、定量試劑盒Quant Kit、玻璃板硅烷化劑、固相IPG干膠條、IPG buffer、三氟乙酸、熒光標記試劑盒[CyDye DIGE Flour (minimal Dye) Labelling Kit]、Deep purple熒光染料購自美國GE Healthcare公司;正丁醇購自德國Merck公司,乙腈購自美國Fisher公司，測序級胰酶購自美國Promega公司。

1.1.2儀器 等電聚焦電泳儀IPGphor Ⅲ、垂直電泳儀Ettan DALT Six System SDS、掃描儀Typhoon Trio、切膠儀Ettan Picker、酶解儀Ettan Digester、分析軟件DeCyder V7.0 Software均購自美國GE Healthcare公司；MALDI-ToF-ToF質譜儀購自美國Bruker Dalton公司。

1.2方法

1.2.1人冠狀動脈內皮細胞的培養和處理 參考已經報道的方法[5-6]。人冠狀動脈內皮細胞HCAECs購自美國Cell Applications公司，培養按照說明書進行操作，本研究所使用的HCAECs為第4代。藥物處理細胞之前，改為含0.1 % 胎牛血清且不含細胞因子的EGM-2基礎培養基培養24 h。實驗組為HCAECs用1 μmol/L雷帕霉素處理4 h。

1.2.2樣品處理 在4 ℃預冷蔗糖緩沖液(10 mmol/L Tris，250 mmol/L sucrose)中洗滌細胞3次，去除殘余培養基；每個100 mm皿中加入裂解液(7 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，30 mmol/L Tris，4% CHAPS)250 μL，刮下細胞并充分裂解；超聲，4 ℃、12 000 g離心30 min，轉移上清液，進行蛋白質純化。蛋白質的純化和定量嚴格按照2D Clean-up Kit或2D Quant Kit說明書進行。

1.2.3熒光差異雙向電泳(2D-DIGE) 參照報道過的方法[7-8]，采用2D-DIGE研究的標準設計,樣品的熒光標記方法按照CyDye DIGE Flour Labelling Kit說明書操作。每個樣品取50 μg，用400 pmol Cy2、Cy3或者Cy5 在冰浴、避光條件下標記30 min；然后用賴氨酸溶液終止反應。第一向電泳(等電聚焦)程序如下：30 V，12 h，step-n-hold；500 V，1 h，step-n-hold；1 000 V，1 h，step-n-hold；10 000 V，10 h，step-n-hold；Total 85 000 Vh。先后用DTT和IAA溶液進行兩步平衡，然后進行第二向12.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)。

1.2.4凝膠掃描和差異蛋白的獲取 準備制備膠2張(每膠500 μg)，用Deep Purple stain kit進行制備膠的熒光染色。Typhoon Trio掃描儀對2D-DIGE 分析膠和Deep Purple制備膠的圖像進行采集。DeCyder7.0軟件進行差異蛋白分析，在Ettan Picker上切取差異蛋白質樣品。

1.2.5蛋白質鑒定 切取的目的蛋白斑點在Ettan Digester儀器上進行胰酶酶解，然后在MALDI-ToF-ToF質譜儀上進行蛋白質的鑒定，Mascot進行數據檢索。

2 結 果

2.12D-DIGE蛋白質組學研究 雷帕霉素處理后，HCAECs差異表達蛋白有85個，其中上調49個，下調36個，見圖1。

表1 2D-DIGE結合MALDI-ToF-ToF發現的差異蛋白表達

續表1 2D-DIGE結合MALDI-ToF-ToF發現的差異蛋白表達

圖1 雷帕霉素誘導HCAECs損傷的2D-DIGE研究

2.2差異表達蛋白及其功能分類 挑選2D-DIGE發現的差異蛋白斑點50個，進行MALDI-ToF-ToF質譜鑒定，共鑒定出雷帕霉素誘導的HCAECs差異表達蛋白26種(不含重復的4個)，見表1。主要有以下幾類：內質網蛋白、線粒體蛋白、分子伴侶、結構蛋白和抗氧化蛋白等，符合細胞損傷的特征，見圖2、3。

圖2 雷帕霉素誘導的HCAECs差異表達蛋白的功能分類

圖3 雷帕霉素誘導蛋白HYOU1、ERP44和的表達變化

3 討 論

內皮細胞功能紊亂不僅是動脈粥樣硬化的關鍵因素之一，也是支架后血栓形成的重要原因。雷帕霉素是洗脫支架最常用的藥物之一，其藥理作用主要是誘導細胞周期停滯、抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，從而抑制內膜增生[2-3]。雷帕霉素直接靶向并抑制絲/蘇氨酸激酶mTOR，激活自噬。因此，從分子機制上來說，雷帕霉素具有阻滯細胞周期、抑制細胞的增殖和遷移，以及誘導細胞損傷的作用。

為了系統研究雷帕霉素對人冠狀動脈內皮細胞作用的分子機制，筆者采用了蛋白質組學的策略，利用2D-DIGE結合MALDI-ToF-ToF的方法。本研究共發現差異蛋白斑點85個，質譜鑒定出其中的26種蛋白質。包括內質網蛋白、線粒體蛋白、分子伴侶、泛素系統相關蛋白等，符合細胞損傷的特征。本研究發現的內質網蛋白包括HYOU1(即ORP-150)、PDIA3(即ERP57)、TXND5(即ERP46)、ERP44,這幾類蛋白與內質網應激相關,提示雷帕霉素損傷內皮細胞的機制之一可能是通過內質網應激。HYOU1在血管細胞中通過抑制內質網應激損傷發揮作用[9]。雷帕霉素誘導了HYOU1下調1.63倍，促使其保護效應減弱。筆者發現雷帕霉素下調了ERP44表達2.11倍，報道稱干擾ERP44的表達會促發內質網應激損傷[10]，而ERP57表達上調可能是一種應激性反應。已經報道雷帕霉素的靶點mTOR與內質網應激之間的關系較為復雜，存在多種形式的互相影響[11-12]。眾所周知，雷帕霉素是自噬研究最常用的誘導劑。雷帕霉素誘導內質網自噬的機制之一就是mTORC1與ATG1/ULK復合物分離，

促使內質網自噬的成核和延伸[11]。內質網自噬已經成為當前研究的一個熱點。雷帕霉素誘導內皮細胞內質網自噬是通過怎樣的機制，也是以后值得關注和深入研究的一個方向。

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