傳染性蛋白的“負面”和“正面”（8）

朱欽士（美國南加州大學醫學院）

（上接2018年第10 期第10頁）

3.3 Prion 型的蛋白為休眠中的卵細胞儲存“嫁妝”卵細胞生成后，常要等待很長的時間才能被使用。 例如，人的卵細胞在女孩尚未出生時就形成了，要過十幾年，甚至幾十年后才成熟并被使用，在此之前卵細胞就一直處于休眠狀態。 一個有趣的現象是，從線蟲、果蠅到脊椎動物，卵細胞在形成的初期都會在細胞內生成一個高密度的團狀物，界限清晰而又沒有膜包裹，稱為“巴比阿尼體”（Balbiani body）。 它只存在于休眠期的卵細胞中，在卵細胞成熟時則消失。

檢查巴比阿尼體的組成成分，發現它含有RNA 和線粒體，被認為是卵細胞在休眠狀態時儲存RNA 和線粒體的一種結構，其作用是保護這些RNA 分子和線粒體，以便在卵細胞成熟受精后使用，有點像卵細胞的“嫁妝”或者“細軟”。

形成巴比阿尼體結構的主要是一種蛋白質，在斑馬魚中稱為“布基球蛋白”（Bucky ball），在青蛙卵中稱為Xvelo。它們的氨基端都含有能轉變為橫向β-折疊，形成Prion 型結構的功能域。它們形成的聚合物能抵抗高濃度的鹽溶液，在高溫下也不解離，且能結合硫黃素T，說明它們形成的聚合物具有Prion 型的結構。

敲除斑馬魚的Bucky ball基因，或青蛙的Xvelo基因，卵細胞中就沒有巴比阿尼體形成，說明這些蛋白對于巴比阿尼體的形成是必要的。 用其他傳染性蛋白的Prion 功能域取代這2 種蛋白的Prion 功能域，這樣生成的蛋白雖然也能形成Prion 型的聚合物，但是卻不能形成巴比阿尼體，也不會進入已經形成的巴比阿尼體，說明形成巴比阿尼體的蛋白有自己特異的Prion 功能域，形成的聚合物也有自己的結構和性質，是其他的傳染性蛋白無法取代的。

3.4 Prion 型的蛋白形成“分子手銬”抑制質粒DNA的復制 質粒（plasmid）是染色體外的環狀DNA，主要存在于細菌中。 質粒常帶有對細菌有益的基因，例如抵御抗菌素的基因。 質粒能自我復制，且通過細菌之間由細絲形成的通道從一個細菌傳播至另一個細菌。

質粒既然可自我復制，一個細菌也就可含有多個質粒。細菌細胞中質粒的數量是受控制的，既不能太少，也不能太多。 假單孢桿菌（Pseudomonas syringae）所含的質粒稱為Psudomonas pPS10，其復制過程受一個蛋白RepA（replication protein A）的控制。RepA 既能讓質粒復制，又不讓它過分復制，其機制就包括RepA 的Prion 形式。

RepA 蛋白由質粒自身的DNA 編碼，由320個氨基酸殘基組成。 它含有2 個WH（winged helix）功能域WH1 和WH2，都由α－螺旋組成。 在α-螺旋結構不變的情況下，一個RepA 分子上的WH1 域能與另一個RepA 分子上的WH1 域結合，形成RepA 的同質二聚體。 WH2 域含有結合質粒復制起始點DNA 序列的界面。 在RepA 二聚體通過WH2 域，結合到質粒的復制起始點時，二聚體解離，變成單體。 單體的RepA 能作為質粒復制的啟動蛋白，開始質粒的復制。

RepA 蛋白單體與質粒DNA 的結合也改變其WH1 功能域的結構，使其轉變為橫向的β-折疊，而WH2 域的結構并不改變，仍然能結合DNA。 結合在2 個質粒上的RepA 蛋白單體通過變為Prion型結構的WH1 功能域彼此結合，將質粒復制完成后形成的2 個質粒連在一起，像一根繩子拴住2個環，類似手銬的形狀，所以這種情形叫做將2 個質粒“銬”起來（handcuffed）。 由于質粒上的復制起始點被掩蓋，質粒也不能進一步被復制，因此這種手銬結構能防止質粒過度復制。 在質粒需要再復制時，由3 個伴侶蛋白DnaK-DnaJ-GrpE 組成的復合物可對質粒進行“解銬”，使質粒恢復“自由身”，再由RepA 進行復制。

由WH1 功能域聚合成的結構能結合剛果紅，并將其吸收峰紅移至500 nm，說明WH1 形成的聚合物確實具有Prion 型的結構。

假單胞桿菌中RepA 蛋白的例子說明，有些蛋白分子可有2 種結構和2 種功能狀態。在RepA分子通過WH1 功能域形成同質二聚體時，分子還是由α－螺旋組成，分解為單體后也以α－螺旋的結構執行復制質粒的工作。 WH1 功能域變為橫向β-折疊后，RepA 分子也形成二聚體，但卻是通過β-折疊的結構而結合，其功能不再是復制質粒，而是將2 個質粒連在一起，阻止質粒復制。 在這里，Prion 型結構的蛋白也有正常的生理功能，與引起疾病的傳染性蛋白變為Prion 型結構后喪失正常的生理功能不同。當然Prion 型結構的蛋白質殺傷細胞也可以算作一種“功能”，但并非正常的生理功能。

RepA 蛋白的例子也說明，Prion 型結構的蛋白，即使在細菌的細胞內，也可以是沒有毒性的。下一個例子是Prion 型結構的蛋白在哺乳動物的細胞內，不但沒有毒性，還執行重要的生理功能，這就是Pmel17 蛋白在黑色素形成中的作用。

3.5 Prion 型的Pmel17 蛋白作為黑色素合成的模板 黑色素（melanin）是生物合成的色素。 生物以酪氨酸為原料，經過幾個氧化步驟，再進行聚合，形成黑色素。 黑色素能吸收光線，包括可見光和紫外光。在皮膚中，位于上皮底層的黑色素細胞（melanocyte）合成黑色素，保護皮膚不受紫外線的傷害。 在眼中，黑色素由視網膜上的色素細胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）合成，其作用是遮光，避免光線從視網膜的后面進入感光細胞。黑色素是在細胞的黑色素體（melanosome）中合成的。 黑色素體是細胞的一種細胞器，有膜包裹，膜內環境為酸性（pH 值5.0 左右）。

1930年，在小鼠身上發現了一個基因，它的突變會使小鼠合成黑色素的功能受到阻礙，小鼠身體為白色，因而被稱為“銀白基因”（silver gene）。 到了1991年，此基因被克隆，出人意料的是，這個基因與黑色素合成的化學反應并沒有直接關系，而與黑色素體的形成有關，因為被稱為“前黑色素體蛋白”（premelanosome protein 17，Pmel17）。 用電鏡檢查黑色素體，發現其中有定向排列的纖維，黑色素就在這些纖維上生成，組成這些纖維的是Pmel17蛋白。

Pmel17 起初是一個膜蛋白，即通過蛋白質的穿膜區段與黑色素體的膜相聯系，其主要部分伸入至黑色素體腔內。 蛋白酶將Pmel17 蛋白切為2段： 仍然與膜聯系的Mβ 段和在腔內的Mα 段。Mβ 段隨后被降解，而Mα 段則改變肽鏈折疊狀況，形成橫向β-折疊，聚合成為纖維。這些纖維能被剛果紅和硫黃素T 染色，證明它的確具有Prion型的結構。

研究發現，Pmel17 纖維能作為模板，使得形成黑色素的前體分子能在其上聚合，最后形成黑色素。沒有Pmel17 蛋白，黑色素則無法形成。有趣的是，引起阿茨海默癥的Aβ 蛋白和引起帕金森氏癥的“α-突觸核蛋白”（α-synuclein，見文章第1部分）也能促使黑色素的形成，說明是Prion 型蛋白的結構作為黑色素前體分子聚合的模板。

從本文的前2 個部分知道，Prion 型結構的蛋白，特別是在低聚狀態時，可能會對細胞產生毒性。 Peml17 蛋白就是在細胞內聚合的，怎樣避免其毒性？生物采取的辦法一是隔離，即這個聚合過程在被膜包裹的黑色素體中發生；二是讓Pmel17聚合為Prion 型蛋白的過程盡可能快速，這樣低聚物就沒有時間對細胞造成傷害。 在大腸桿菌內合成的Pmel17 的Mα 片段在高濃度（8 mol/L）的尿素（破壞蛋白結構的分子）溶液中能以可溶狀態存在，但是一旦尿素溶液被稀釋，Mα 片段在數秒時間內就聚集成纖維，比Aβ 蛋白片段聚合的速度快萬倍，這就防止了低聚合度的Pmel17 纖維與細胞內容物接觸的機會。

合成黑色素的中間產物在化學性質上也非常活潑，還有可能經由擴散通過黑色素體的膜進入細胞質，與其他分子發生化學反應而傷害細胞。讓這個聚合過程在黑色素體內的Pmel17 纖維上發生，即可防止中間產物與細胞中的其他分子接觸，不至于傷害到細胞。 因此，Pmel17 纖維作為黑色素前體分子聚合的模板，具有催化和吸附的雙重意義。

3.6 Prion 型的牙釉蛋白作為牙釉形成時羥磷灰石晶體聚合的模板 牙釉（enamal）是牙齒最外面的部分，是生物材料中硬度最高的。成熟的牙釉主要由單晶體的羥磷灰石（hydroxyapatite）組成，這些晶體直徑約50 nm，長數百μm，所以成纖維狀。而在牙釉形成的過程中，Prion 型結構的牙釉蛋白（amelogenin）對羥磷灰石的聚合起到模板作用。

在牙釉形成的初期，成釉細胞（amelocyte）分泌多種成釉蛋白，其中主要是牙釉蛋白。牙釉蛋白由175 個氨基酸殘基組成，其氨基端是親脂的，能形成橫向β-折疊的結構，而其羧基端含有若干帶電的側鏈，能與鈣離子和磷酸根結合。在鈣離子和磷酸根存在的環境中，氨基端會改變折疊狀態，形成Prion 型的結構，能被剛果紅和硫黃素T 染色，光學測定也證實了其纖維的橫向β-折疊結構。這樣形成的纖維就作為羥磷灰石晶體生長時的模板，且形成的纖維狀晶體的方向也與釉質蛋白小纖維的方向一致。

在釉質形成的過程中，成釉細胞也會分泌蛋白酶Kallikrein-4（KLK4），將牙釉蛋白逐漸降解，騰出空間使更多的羥磷灰石纖維生長，因此在成熟的牙釉中，牙釉蛋白已不復存在，其作用只是在牙釉形成的初期以Prion 小纖維的形式為羥磷灰石晶體的生長提供模板。

3.7 Prion 型的結構可能作為植物中橡膠形成時的模板 橡膠是橡膠樹（Hevea brasiliensis）合成的，由異戊二烯單位組成的聚合物。在合成橡膠的細胞中，異戊二烯的聚合物存在于一種球形的“橡膠顆粒”（rubber partical）中。顆粒的內部是異戊二烯的聚合物，表面是一層脂膜，脂膜內有合成橡膠的酶，異戊二烯轉移酶（prenyltrnasferase），它可以催化單體的異戊二烯二磷酸 （isoprenyl pyrophosphate）中的異戊二烯部分被加到聚合物上，使聚合物的鏈不斷伸長。 細胞質中的異戊二烯二磷酸從橡膠顆粒的表面與轉移酶接觸，被添加到顆粒內的聚合物上，使得顆粒不斷長大。

研究發現，異戊二烯轉移酶并不能單獨催化此反應，而是需要膜中的另一個稱為“橡膠延長因子”（rubber elongation factor，REF）的蛋白。 從橡膠顆粒上去除REF，會使異戊二烯轉移酶無法將異戊二烯單位添加至聚合物上。

有趣的是，REF 能聚合，形成Prion 型的結構。光譜測定，包括圓二色性測定，表明單體的REF蛋白主要含有α-螺旋，而聚合狀態的REF 含有β-折疊。 這個聚合物能被剛果紅染色，X-射線衍射實驗證實了橫向的β-折疊結構。 由于REF 并不直接參與化學反應，REF 蛋白對橡膠合成的必要性有可能像黑色素的合成那樣，以其Prion 結構作為異戊二烯形成聚合物時的模板。

（待續）