水環境中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲檢測方法的研究進展

張澤清

（太原供水集團有限公司水質監測中心，山西太原030009）

隨著我國經濟的不斷增長和人民生活水平的不斷提高，人們對飲用水的衛生狀況越來越注重。病原微生物是威脅水環境衛生狀況的一個非常大的因素，賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲則是其中的典型代表，其危害一直受到國際社會的關注和重視。兩蟲在感染人體后具有潛伏期長、個體小、致病率高等特點，當兩蟲感染人類后，常使患者人體出現發燒、腹瀉等癥狀，甚至會導致患者的死亡。通過優化水處理工藝可以起到一定的去除效果，但由于其對傳統的氯消毒劑有較強的抗性，在水環境中存活時間長，因此并不能將其完全消除[1]。只有加強實時監測，根據監測結果采取針對性的措施，才能有效降低兩蟲的危害。

1 賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的危害

兩蟲廣泛寄居在大自然的各類水體中，其蟲卵可以長期存在于水體中，人一旦飲用被兩蟲污染的水，就極有可能發病。兩蟲主要來自于養殖場、農場和屠宰場，通過排放的受污染水，來對其他水環境造成污染。

賈第鞭毛蟲主要寄生在人體的腸道系統內，兒童、老人、體弱多病人員是極易感染者。當人體感染該病原體后，會在人體內繁殖出孢囊，可以隨人體的排泄過程而排出體外，并可能再次進入到水環境中。它們可以在水環境中存活較長的時間，當溫度適宜時，可以在水環境中存活超過3個月，并隨著人類飲用受到污染的水，而再次進入到人體。

隱孢子蟲屬于一種細胞內的寄生蟲，人畜皆可患病，其傳播途徑較為廣泛，當人接觸到受污染的水源、食物、動物后，就有可能患上該病，它們還能以卵囊的形式被排出到體外，如果被排放進飲用水源內，就有可能造成人類的循環感染。該蟲卵進入到水體后，雖然不能進行自我復制和繁殖，但對絕大多數的消毒劑都有免疫效果，且可以在水環境中存活很長的時間，有些蟲卵可以存活1年以上。

2 賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的檢測方法研究

美國是最先開始進行兩蟲檢測的，其首先發明了硫酸鋅-羅果氏法，后經過多代研究技術人員的努力，檢測方法越來越多，其中較為先進的檢測方法有ICR法、EPA1623法、聚合酶鏈式反應法、反轉錄PCR法、嵌套PCR法和熒光雜交法等。其中免疫熒光法的應用最為廣泛，目前成為國際上通用的兩蟲檢測方法[2-4]。

ICR法是應用最早的一種兩蟲檢測方法，又稱為梯度分離法。蔗糖漂浮法和福爾馬林-乙酸乙酯法主要利用了各種組分比重不同的原理，從而實現了對孢囊和卵囊的分離和回收。但這種方法在實際應用過程中，易被多種因素所干擾，從而導致該方法檢測結果準確性較低。

隱孢子蟲免疫分離法產生于美國，并取得了不錯的發展，后來將其應用到賈第鞭毛蟲的檢測中，便形成了現在的EPA1623方法。其應用的主要原理是帶有兩蟲抗體的磁珠可以專一地和兩蟲發生反應，并形成兩蟲和磁珠的復合物，在經過特殊處理的磁場中，可以有效地分離和提純該復合物。在酸性溶液中，可以重新將兩蟲和磁珠分離，然后對其熒光染色，最后通過顯微鏡計數。

碳酸鈣沉淀濃集法也是常用的兩蟲檢測方法，先在水樣中加入氯化鈣和碳酸鈉，并通過添加氫氧化鈉將溶液pH值提高到10左右，這時碳酸鈣會結晶，其結晶大小和蟲卵囊相近，并會產生沉淀現象，通過對沉淀物的收集，并加硫酸后的離心濃縮，最后對其進行染色檢測。

在以上三種方法中，ICR和免疫磁分離法比較成熟，目前免疫磁分離法發展較為迅速，且很好地克服了ICR法所存在的不足，因此在實際檢測中，EPA1623法被越來越廣泛地應用，筆者將在下文中簡要介紹其實際檢測中的關鍵步驟。

2.1 EPA1623免疫磁分離法的關鍵步驟

由于實際水環境中的兩蟲數量較少，因此在得到水樣本后，需選擇1μm的濾囊過濾水樣，將其緊密連接到采樣接口處，并保證在加壓后不會脫開。在過濾過程中，將泵流量控制在2 L/min，在采集到足夠的水樣后，立即關閉蠕動泵。

在濾囊使用完畢后，及時將濾囊放空，并盡量排空濾囊中的水分，一定要盡量保證水從下口排出。在排水完畢后，淘洗濾囊，在淘洗過程中，將搖臂的擺角控制在90°左右，充分將包囊和卵囊從濾囊上分離下來。

將采集得到的過濾液放入到錐形離心管內，并進行1 500 g的離心分離，在離心完成后，小心移除上清液，此過程一定要小心謹慎，避免將溶液弄混。如果所得的沉淀物小于或等于0.5mL，可一次將其轉移到側平面管中，如果體積超過0.5mL，需要分次轉移，保證每次轉移的量不超過0.5mL，在轉移完畢后，做好對沉淀物的標記。

先將Buffer-A溶液和Buffer-B溶液各1mL加入到側平面管，再加入離心溶液加入，并將兩次潤洗離心管后液體也一并轉入，然后分別加入DynabeadsGiardia-Combo和DyanabeadsCrypto-Combo各100μL。將上述混合液放在25 r/min的攪拌器上旋轉1 h后，再將其放入到磁濃縮器MPC-1中90°旋動2 min，倒出上清液后，再加入1 mLBuffer-A溶液，隨后輕柔地將其轉移到1.5mL的離心管內，再放入另一個磁粒子濃縮器MPC-M中，搖動1 min后，吸出上清液，隨之對溶液加酸酸化，并放置在載玻片上，采用二次酸化的方法，來提高其回收率。

此時應該進行對樣本的染色工作。先在樣本上滴一滴甲醇，并在干燥后，加入熒光染色液，靜置30 min后，再加入DAPI染色劑，2 min后清洗，然后加入一滴固劑封片。

按一定的順序在鏡片上進行掃讀，此時，就可以利用熒光反應、DAPI染色特性、DIC觀測鏡片。在藍光激發下，賈地鞭毛蟲孢囊會呈現帶明亮蘋果綠色的橢圓形，在紫外光下，孢囊內部還會呈現出藍色的核。還可以通過DIC觀察到刺突、柄、附屬物等典型結構。隱孢子蟲的卵囊在藍光熒光的激發下，則呈現出明亮蘋果綠的微橢圓的圓形，在紫外光下，卵囊還會呈現出藍色的核。

在試驗過程中，要嚴格控制各種檢測工藝的時間，并做好試驗的防護工作，防止受到病原體的感染。

3 結語

隨著人們生活水平的不斷提升，人們對飲水的衛生情況提出了更高的要求。賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲在進入到人體后，會對人體健康產生很大的威脅，因此對其防范工作十分重要。為了對兩蟲進行有效的防范，必須做好水環境中的檢測工作。目前對兩蟲的檢測方法較多，其中免疫磁分離法發展較快，并取得了不錯的應用效果。但該方法的操作較為復雜，想要得到更準確、更高效的試驗結果，還需要檢測人員不斷提高自己的檢測技能。

[1]崔福義,左金龍,趙志偉,等.飲用水中賈地鞭毛蟲和隱孢子蟲研究進展[J].哈爾濱工業大學學報,2006,38(9):1487-1491.

[2]張致一,李聞,于凌琪,等.天津和沈陽末梢水中賈地鞭毛蟲和隱孢子蟲調查[J].環境與健康雜志,2009,26(1):52-53.

[3]韓范,譚渭仙,周性蘭.南京地區人體隱孢子蟲病2例報告[J].江蘇醫藥,1987(13):692.

[4]鄧明俊,肖西志,孫濤,等.藍氏賈地鞭毛蟲檢測技術研究進展[J].動物醫學進展,2012,33(12):168-173.