槐米藥材薄層色譜鑒別研究

黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 凱里 556000

蘆丁(Rutin)又名蕓香苷，是一種分布廣泛的黃酮類(lèi)化合物，具有維生素P樣生理活性[1]，主要存在于槐米、蕎麥、小薊、銀杏葉、鬼針草等植物中[2-6]。槐米為豆科植物槐SophoraJaponicaL.的干燥花及花蕾，主要分布在河南、山東、陜西、湖南、貴州、四川等地[7]。槐米中含有豐富的蘆丁成分，其含量可達(dá)12%～20%[2]，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)蘆丁具有涼血止血、清肝瀉火等功效，且具有抗癌防癌、抗血小板聚集、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗炎、抗過(guò)敏、抗自由基及抗氧化等多種活性[8-10]。臨床將蘆丁用于預(yù)防和治療糖尿病及合并高脂血癥[11]。此外，蘆丁作為食品中的抗氧劑和天然食用色素。《中華人民共和國(guó)藥典》2015版[8]收載槐米中蘆丁的薄層色譜鑒別采用的展開(kāi)劑是乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)，研究擬對(duì)蘆丁薄層色譜鑒別的展開(kāi)系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，選用其他展開(kāi)劑代替藥典方法，為生產(chǎn)上蘆丁的鑒別提供更多的選擇。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，已篩選出了一種展開(kāi)劑，使得供試品中所鑒別的成分斑點(diǎn)清晰，分離度好，重復(fù)性好，可以代替原標(biāo)準(zhǔn)用于蘆丁的鑒別。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ZF-I型三用紫外分析儀(上海光豪分析儀器公司)；點(diǎn)樣毛細(xì)管(上海申立玻璃儀器公司)；層析缸。

1.2 材料 硅膠G(青島海洋化工有限公司)；薄層板(自制)。甲醇、乙酸乙酯、甲酸、丙酮等均為分析純。蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：201509，貴州省迪大科技有限公司)，三氯化鋁顯色劑。槐米藥材購(gòu)于黔東南州藥材公司(批號(hào)：20160201)。

2 方法

2.1 薄層板的制備 取羧甲基纖維素鈉0.2～0.5 g，溶于100 mL水中，攪拌，微熱使其完全溶解，再加入薄層層析硅膠G適量，沿同一方向研磨成均勻的稀糊，然后均勻地涂在預(yù)先準(zhǔn)備好的潔凈的玻璃板上，晾干。使用前110℃活化30 min，置于干燥器內(nèi)備用。

2.2 供試品溶液的制備 取槐米粉碎，過(guò)篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取20 g，加0.4%的硼砂水溶液200 mL，攪拌均勻，用石灰水調(diào)pH8～9，煮沸30 min ，保持水分和pH不變，提取兩次，合并濾液，用鹽酸調(diào)pH2～3，抽濾，精制，烘干，得蘆丁精品。稱(chēng)取蘆丁粉末0.2 g，加甲醇5 mL，密塞，振搖10 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液制備 取蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇制成2 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液，備用。

2.4 薄層層析方法

2.4.1 改進(jìn)方法 照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2015版通則0502)試驗(yàn)，分別吸取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各5μL ，點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，采用預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的四種展開(kāi)劑：A.乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(5∶2∶0.5∶0.5)，B.乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1 )，C.乙酸乙酯-丙酮-水(5∶3∶1)，D.乙酸乙酯-甲醇-水(4∶1∶1)分別展開(kāi)，取出，晾干。噴以三氯化鋁試液顯色，待晾干后，置紫外燈(365 nm)下檢視蘆丁，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4.2 藥典方法 照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2015版通則0502)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各10μL ，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

表1 不同展開(kāi)劑的薄層展開(kāi)效果

展開(kāi)劑斑點(diǎn)清晰度展開(kāi)時(shí)間/min藥典標(biāo)準(zhǔn)圓整,清晰20A圓整,清晰25B有少許拖尾現(xiàn)象,清晰40C拖尾嚴(yán)重,模糊58D拖尾,清晰60

3 討論

蘆丁在四種展開(kāi)劑中薄層鑒別見(jiàn)圖1，與藥典方法展開(kāi)效果的比較見(jiàn)表1。由圖1、圖2和表1可知，選用的四種展開(kāi)系統(tǒng)中，蘆丁在展開(kāi)劑A中展開(kāi)的效果最好，斑點(diǎn)圓整且清晰，展開(kāi)時(shí)間是最少的，為25 min，藥典標(biāo)準(zhǔn)是20 min，展開(kāi)劑B乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1 )斑點(diǎn)清晰但有少許拖尾現(xiàn)象，展開(kāi)劑C 乙酸乙酯-丙酮-水(5∶3∶1)拖尾嚴(yán)重，斑點(diǎn)模糊。

在展開(kāi)劑 D 乙酸乙酯-甲醇-水(4∶1∶1)中展開(kāi)時(shí)間太長(zhǎng)。綜上，實(shí)驗(yàn)篩選出的理想展開(kāi)系統(tǒng)為乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(5∶2∶0.5∶0.5)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)展開(kāi)環(huán)境的溫度和相對(duì)濕度進(jìn)行了考察，結(jié)果溫度在20～25℃，相對(duì)濕度在25%～65%，供試品色譜中主要斑點(diǎn)的分離度較好。對(duì)改進(jìn)后的方法進(jìn)行了穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，樣品在6 h內(nèi)進(jìn)行薄層鑒別，供試品色譜中主要斑點(diǎn)的分離度較好，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明，改進(jìn)后的方法重復(fù)性良好。實(shí)驗(yàn)采用三氯化鋁的乙醇溶液作為顯色劑。中藥分析中，三氯化鋁是廣泛應(yīng)用于黃酮類(lèi)成分定性、定量分析的顯色劑，能與蘆丁成分顯色并產(chǎn)生熒光。可用于本研究中槐米蘆丁的薄層層析鑒別。

研究對(duì)展開(kāi)劑的種類(lèi)及配比進(jìn)行了大量摸索。嘗試乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶3)、甲醇-水、丙酮-水作為展開(kāi)劑，結(jié)果顯示展開(kāi)結(jié)果無(wú)顯著差異，而且展開(kāi)速度很慢，其中乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶3)有分層現(xiàn)象。最終選用乙酸乙酯-甲醇—甲酸-水為展開(kāi)劑，比例5∶2∶0.5∶0.5為佳，分離效果好，斑點(diǎn)Rf值適宜。與藥典原標(biāo)準(zhǔn)相比較，實(shí)驗(yàn)篩選出的展開(kāi)劑系統(tǒng)中乙酸乙酯、甲酸的用量都減少，不僅不會(huì)影響槐米中蘆丁的鑒別，還節(jié)約了成本，同時(shí)減少有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境的污染，有著更廣泛的應(yīng)用意義，可替代原標(biāo)準(zhǔn)用于槐米蘆丁的薄層鑒別。

[1]李秋紅，欒仲秋. 槐米提取工藝研究綜述[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)信息，2014(13)：133-134.

[2]史方超，喬立業(yè)，陸肶等.槐米提取物的制備工藝及其紫外吸收特性考察[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015,12(22)18-22.

[3]黃菊，翟淑敏.正交設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥中蘆丁提取工藝的比較[J]. 糧食與油脂，2014,27(9)：45-48.

[4]黃麗. HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定中藥小薊中6種活性成分的含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016,22(4):66-68.

[5]魏若男，陳志遠(yuǎn)，耿敬章.毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)銀杏葉中的蘆丁[J]. 現(xiàn)代食品科技 2017，33(11)：257-261.

[6]布紫云，曲婷麗，趙正保.中藥材鬼針草的定性和定量研究[J].光明中醫(yī).2016，31(2)：211-213.

[7]李振志，朱華，謝鋒，等.不同產(chǎn)地槐米中蘆丁的含量測(cè)定[J]. 世界中醫(yī)藥，2013，8(8)：952-954.

[8]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：355.

[9]劉麗麗，李曉霞，陳玥，等.槐米化學(xué)成分研究[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,33(4)：230-233.

[10]張浪，賴(lài)永長(zhǎng)，汪海濤，等.蘆丁對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J].中藥材，2014，37(4)：640-644.

[11]楊德全，葉建陽(yáng)，劉鴻云，等. 從苦蕎麥中提取蘆丁的研究[J]. 延安大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 1997, 16(4):67-71.