白藜蘆醇靶向mTORC2/Rictor抑制HUVECs的增殖遷移及管腔形成

李明珠，劉麗喬，劉卓琦，王 群

(南昌大學 1.第一臨床醫學院； 2.基礎醫學院 生物化學與分子生物學教研室； 3.第一附屬醫院 心胸外科，江西 南昌 330006)

冠狀動脈旁路移植術是外科治療心血管疾病的重要手段[1]。自體大隱靜脈是手術最常見的選擇[2]，但其遠期通暢率并不理想，術后1年有超過20%的靜脈出現再狹窄，該比例在術后10年提升至60%[3]。臨床上主要用2類抗增殖劑來預防再狹窄：雷帕霉素靶蛋白抑制劑和紫杉醇及其衍生[4]。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, mTOR) 是生長因子和細胞因子下游的主要信號傳導通路，參與調控細胞存活、增殖和分化；其存在兩種結構和功能不同的多蛋白復合物mTORC1和mTORC2[5]，兩者的活性分別由特異性輔助因子(包括Raptor和Rictor)調節[6]。它們對mTOR抑制劑的敏感程度不同是長期使用mTOR抑制劑導致不良反應的主要原因之一[7]，靶向抑制mTOR通路是提高再狹窄治療效果和減輕毒性反應的新思路。

小型酚類化合物白藜蘆醇(resveratrol, Res)廣泛存在于葡萄、花生和藜蘆等多種植物中，因其天然無毒等特點，近年來頗受中老年慢性病患者的青睞，在食品、藥品及保健品領域應用廣泛。白藜蘆醇還具有心血管保護功能[8- 9]，有望成為一種對抗移植物再狹窄的備選藥物[10]。本研究以腺病毒為載體，介導人臍靜脈內皮細胞Rictor基因過表達，觀察白藜蘆醇對HUVECs增殖、遷移及體外管腔形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

白藜蘆醇(純度99%，Sigma公司)；用DMSO溶解配成100 mmol/L的原溶液, -20 ℃避光保存，實驗前以RPMll640培養液稀釋至使用濃度50 μmol/L；人臍靜脈內皮細胞(ATCC公司)；GV341載體體系、HEK 293T細胞系和TOP10感受態細胞(上海吉凱公司)；pBHG lox ΔE1,3 Cre(Microbix公司)；限制性核酸內切酶(NEB公司)；Taq DNA多聚酶(Sinobio公司)；LipofectamineTM2000 (Invtrogen公司)；In-FusionTMPCR 克隆試劑盒(Clontech公司)；兔抗人Rictor單克隆抗體(CST公司)；辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔和兔抗鼠抗體(Santa Cruz公司)；CCK- 8試劑盒(日本同仁公司)。

1.2 方法

1.2.1 Rictor重組穿梭質粒的構建：利用cDNA文庫，參照人源Rictor (NM_152756) 基因序列相關信息設計PCR引物，Rictor-P1:5′-AGGTCGACTCTAGA GGATCCCGCCACCATGGCGGCGATCGGCCGCGGCC GCTCTCTGAAGAACC-3′；Rictor-P2:5′-TCCTTGTA GTCCATACCGGATTCAGCAGATGTATCAACTATAGG TTGCTTTGGTG-3′。利用上述引物進行PCR擴增，產物經2%瓊脂凝膠電泳回收目的基因片段。BamHⅠ/AgeⅠ雙酶切回收的DNA片段與GV314載體(圖1A)，用In-fusionTM PCR克隆反應體系，42 ℃ 15 min連接。產物轉化TOP10感受態細胞，對抗性克隆進行測序分析，將正確克隆菌液擴大培養、抽提。

圖1 GV314載體(A)和輔助包裝質粒(B)圖譜 Fig 1 Profiles of vector GV314 (A) and helper plasmid (B)

1.2.2 重組腺病毒載體的包裝、擴增：用AdMax腺病毒包裝體系，將上述重組質粒與輔助包裝質粒pBHG lox ΔE1, 3 Cre(圖1B)混合，通過脂質體試劑LipofectamineTM2000共轉染293T細胞，用Cre/loxP重組酶切割系統獲得重組腺病毒。293T細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，轉染前2 h更換為無血清培養基，后與DNA/ LipofectamineTM2000復合液混合，培養6 h后更換為完全培養基。約10 d大部分細胞出現病變效應，經-70 ℃/37 ℃反復凍融，收集重組腺病毒初始液重復感染293T細胞2次，按照純化試劑盒的步驟收集病毒，命名為Ad-Rictor(pAV-MCMV/Rictor-GFP- 3FLAG)。陰性對照組Ad-Null(pAV-MCMV/-GFP)構建方法同上。

1.2.3 Rictor過表達腺病毒感染HUVECs：常規培養HUVECs，選擇對數增殖期的細胞分別用Ad-Null和Ad-Rictor感染，48 h后通過熒光顯微鏡觀察空細胞、Ad-Null及Ad-Rictor感染的細胞；提取各組細胞的總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離、轉膜、封閉，以1∶1 000比例加入一抗4 ℃孵育過夜，二抗以1∶5 000濃度室溫孵育2 h。以GAPDH為內參抗體，實驗重復3次。

1.2.4 檢測白藜蘆醇干預對HUVECs生物學行為影響：實驗分為正常細胞對照組(control)、空載體陰性對照組(Ad-Null)、Rictor過表達組(Ad-Rictor)和白藜蘆醇干預組(Ad-Rictor+Res)。

CCK- 8試劑盒檢測HUVECs增殖活力。細胞按照實驗分組接種于96孔板(1.0×104個細胞/ mL)常規孵育24 h，每孔加入10 μL CCK8試劑。酶標儀檢測450 nm光波處的每孔吸光度值A，各重復孔取均值。

劃痕檢測HUVECs遷移能力。取對數期HUVECs制備細胞懸液(稀釋濃度約8×104個/mL)接種于6孔板，待細胞增殖至90%匯合以上，用微量移液器槍頭均勻地在每孔中十字劃線，洗凈死細胞后加入等體積含或不含白藜蘆醇的培養基，常規培養動態檢測24 h。

體外成管實驗檢測HUVECs管腔形成能力。24孔板預冷，每孔加入200 μL液化的Matrigel膠，平衡20 min后凝固備用。取對數期細胞制備細胞懸液，細胞板計數后加或不加白藜蘆醇，并稀釋細胞約5×104個/mL；鋪好膠的24孔板每孔加入800 μL細胞懸液，常規培養48 h后拍照。每孔分別取5個部位(上、下、左、右及中間)拍照計算成管數量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 目的基因Rictor擴增結果

PCR產物電泳圖可見一約5 168 bp的特異性條帶，與目的基因Rictor一致(圖2)。

1.DNA ladder; 2.DNA fragment圖2 Rictor基因克隆電泳圖Fig 2 Amplification of Rictor gene

2.2 重組腺病毒感染HEK 293T細胞

熒光顯微鏡觀察，被感染的細胞可檢測到綠色熒光蛋白發出的熒光，說明Rictor過表達腺病毒載體構建成功，感染效率較高(圖3)。

2.3 重組腺病毒感染HUVECs并上調Rictor蛋白表達

熒光顯微觀察HUVECs發現大量被Ad-Null和Ad-Rictor感染的細胞發出綠色熒光，而對照組未檢測到熒光(圖4)。Ad-Rictor組在相對分子質量200 ku處可見顯著的Rictor蛋白表達條帶; 而對照組、Ad-Null組蛋白條帶均表達微弱(圖5)。

圖3 熒光顯微鏡觀察Ad-Rictor感染293T細胞Fig 3 Fluorescent microscopy of 293T cells infected with Ad-Rictor

圖4 Ad-Rictor感染HUVECs的熒光鑒定Fig 4 Fluorescence identification of HUVECs infected with Ad-Rictor

圖5 各組Rictor蛋白表達情況Fig 5 Protein expression of Rictor between groups

2.4 各組HUVECs細胞增殖情況比較

CCK- 8結果顯示，Ad-Rictor組細胞增生數量明顯高于對照組和Ad-Null組(P<0.05)；而Ad-Rictor+Res細胞數量不僅明顯低于Ad-Rictor組(P<0.05)，與對照組相比也有降低(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with Ad-Rictor group圖6 各組HUVECs細胞增殖情況Fig 6 Proliferation activities of HUVECs between

2.5 各組HUVECs細胞遷移能力比較

劃痕實驗顯示，Ad-Rictor組遷移距離與對照組相比有顯著增強；Ad-Rictor+Res組細胞定向遷移能力比Ad-Rictor組有明顯降低(P<0.05)，與對照組和Ad-Null組差異不大(圖7)。

2.6 各組HUVECs細胞體外管腔形成能力比較

血管生成實驗顯示，相比于對照組和Ad-Null組，Ad-Rictor組成形管腔數量明顯增高 (P<0.05)；Ad-Rictor+Res組成形管腔數量顯著低于Ad-Rictor組 (P<0.05)(圖8)。

3 討論

旁路移植手術是閉塞性動脈疾病最常用的血運重建技術，短期內非常有效，但靜脈移植物長期暴露于動脈環境會引起結構性血管壁重塑和內膜增厚，移植術后早期的不良靜脈重塑是移植再狹窄的重要病理基礎[3]。課題組在前期轉錄組測序數據的基礎上尋找基因的突破口，發現mTOR2參與了靜脈移植物的早期重塑，表現為此通路中Rictor基因表達增強，這是在正常靜脈中看不到的[11]。相對于mTORC1，對雷帕霉素不敏感的mTORC2對血管內皮細胞的調節作用更為關鍵[6]；敲除mTORC2的重要組成部分Rictor可以明顯抑制血管內皮細胞增殖和血管生成，但不影響mTORC1信號通路[6,12]。

A.cell wound scratch assay; B.analysis of migration distance in each group圖7 各組HUVECs的遷移能力Fig 7 Migration of HUVECs between n=3)

A.microscopic observation of tubular structure(×200); B.the analysis of the number in each group;*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with Ad-Rictor group

本實驗靶向mTORC2通路構建Rictor過表達腺病毒載體，使其感染研究對象HUVECs。觀察到Ad-Null和Ad-Rictor均具有較高的感染效率，其中在HUVECs的感染效率可達89%；Ad-Rictor能成功上調重組蛋白Rictor表達水平，說明過表達Rictor腺病毒載體構建成功。同時，本研究發現HUVECs的增殖、遷移和血管形成能力隨之顯著增強，進一步證明Rictor是調節血管內皮細胞生物學行為的關鍵因子。

本研究構建的Ad-Rictor體外模擬了靜脈重塑中內皮細胞的Rictor過表達狀態，后加入白藜蘆醇的干預，發現HUVECs的增殖率、體外遷移距離和管腔形成數量均下降。白藜蘆醇對AMPK/mTOR信號通路的調節在其他細胞中已得到驗證[13- 14]，本研究證明了白藜蘆醇對血管內皮細胞的調節作用亦與mTOR2通路有關，表現為抑制內皮細胞在Rictor過表達狀態下的過度增殖、遷移以及血管形成能力。

綜上所述，白藜蘆醇可以靶向mTORC2/Rictor抑制血管內皮細胞的增殖、遷移及管腔形成能力，提示白藜蘆醇可抑制靜脈內皮細胞增生和血管異生，有望成為一種有效預防移植后再狹窄并避免全身毒性反應的天然藥物，為改善旁路移植術后長期結局提供新的治療思路。

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