牛蒡子總木脂素對大鼠視網膜血管內皮細胞遷移及VEGF表達的影響

張華婷 高瑩瑩 徐朝暉

（中藥現代制劑技術教育部工程研究中心，上海中醫藥大學 上海 201203）

糖尿病性視網膜病變（Diabetic Retinopathy，DR）是糖尿病的常見并發癥之一，當前已成為成年人致盲的主要原因,其嚴重性日益引起關注[1]。DR是一種多因素疾病，其發病機制極其復雜。最初，DR被認為是內皮功能障礙的微血管并發癥，然而目前公認的是DR影響幾乎所有類型的視網膜細胞[2]。TLFA是一類從中藥材牛蒡子中分離得到的木脂素類化合物[3]，在前期研究中，我們發現TLFA具有顯著的醛糖還原酶抑制活性[4]，本研究旨在此基礎上，通過測定TLFA對SD大鼠RMECs遷移和VEGF蛋白表達的影響進一步探討TLFA治療DR的理論依據。

1.資料與方法

1.1 一般資料

儀器1-15K型多功能酶標儀（美國Sigma公司）；Stratagene MX3005p型熒光定量PCR儀（美國Agilent公司）；CX23型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

藥物與試劑牛蒡子總木脂素（自制，制備方法見參考文獻[5]）；培養試劑：RPMI-1640，胎牛血清,PBS購自美國Lifetechnologies公司。RNA提取試劑盒購自Ambion公司;逆轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購自Invitrogen公司。

動物SD大鼠5只，雄性，體重250～300g，清潔級，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

圖1 細胞劃痕修復試驗結果

1.2 方法

1.2.1 細胞遷移劃痕修復實驗 參考文獻方法[6]，無菌取下大鼠視網膜神經層，收集RMECs細胞，于37℃、5%CO2培養箱中培養。實驗分為空白對照組(T0)和高(T20)、中(T10)、低(T5)三個劑量組(各組培養基中TLFA的濃度分別為20，10和5mg/L)。每組重復3個，將大鼠RMECs細胞以3×105/孔的密度接種于培養板，以RPMI 1640培養液（含10%胎牛血清）培養。待細胞達到90%生長密度后，改用RPMI 1640（無血清）培養液饑餓培養，24小時后用200μL無菌Tip頭在細胞培養孔中對細胞作一個長條形約0.8mm寬度的劃痕,劃除的細胞用無血清培養液沖洗干凈。按實驗分組加入相應的試劑后，置于5%CO2、37℃的恒溫箱中繼續培養。0,24,48小時后于倒置顯微鏡下拍攝10×10倍的照片記錄。

1.2.2 RT-PCR檢測VEGF表達 在對數生長期取大鼠RMECs細胞，用1640培養基（含10%胎牛血清）制備2×104/mL的細胞懸液，以1mL/孔的量接種于6孔培養板，于恒溫培養箱（37℃、5%CO2）中培養24小時后換液，每組設6個平行孔，按前述分組分別培養24、48、72小時后取樣檢測VEGF表達量。參照試劑盒說明書提取RMECs總RNA,按照cDNA逆轉錄試劑盒的說明書，進行逆轉錄反應。終止反應后，在PCR反應板中加入qPCR Super Mix Universal 10μL，c-DNA 模板 0.5μL，ddH2O 11μL，VEGF(上游5'－TCG GGC CTC CGA AAC CAT GA－3'，下游5'－CCT GGT GAG AGA TCT GGT TC－3')和GAPDH(上游5'－GGA AAG CTG TGG CGT GAT GG－3'，下游5'－TAT CCT TGC TGG GCT GGG TG－3')引物各0.5μL，PCR的反應體系為25μL。PCR反應條件∶50℃，2分鐘，95℃，10分鐘，40cycles；95℃，15sec，60℃，60sec。按照儀器使用說明進行qRT-PCR實驗，收集數據，分析結果。

2.結果

2.1 細胞遷移劃痕修復實驗

如圖所示。當TLFA的濃度為5mg/L時，對RMECs的遷移抑制作用不明顯；當TLFA的濃度分別為10，20mg/L時，在24和48小時兩個時間點均觀察到它們對RMECs的遷移具有顯著的抑制作用，且20mg/L組的抑制作用強于10mg/L組。

2.2 對RMECs VEGF mRNA表達的影響實驗結果見表，經培養24,48,72小時后，（1）T0和T5組內皮細胞VEGF mRNA的表達平緩上升，各時間點兩組數據之間無顯著性差異；（2）T10組內皮細胞VEGF mRNA的表達雖漸次略有上升，但其表達量均明顯比T0組的低，且2組數據之間具有顯著性差異；（3）T20組內皮細胞VEGF mRNA的表達未現增長趨勢，在72小時時還略有下降。其表達量均明顯比T0組各時間點的低，且2組數據之間的差異更加顯著。表明TLFA對微血管內皮細胞的抑制作用呈濃度依賴性，該結果也與細胞劃痕修復實驗結果相符。

表 TLFA對RMECsVEGF mRNA表達的影響n=6,±s

表 TLFA對RMECsVEGF mRNA表達的影響n=6,±s

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.01

分組 VEGF mRNA表達24h 48h 72h T0 0.653±0.059 0.755±0.067 0.876±0.075 T5 0.594±0.052 0.705±0.062 0.838±0.071 T10 0.581±0.046* 0.645±0.053* 0.697±0.062**T20 0.543±0.041** 0.550±0.039*** 0.523±0.043***

3.討論

前期研究發現糖尿病視網膜病變與新生血管形成過程和生長因子過度表達密切相關，視網膜新生血管形成和血-視網膜屏障的破壞在DR的發生發展中起著關鍵作用，而VEGF已經被認為是引起血-視網膜屏障破壞的主要原因[7],其它一些血管滲透性因子通過VEGF間接起作用。因此阻斷VEGF及其受體從而達到治療目的，已成為治療DR的主要思路之一。

本研究細胞劃痕修復實驗結果表明：各濃度TLFA對RMECs的遷移具有不同程度的抑制作用，且抑制作用的強弱呈劑量依賴性。為了進一步探討TLFA對RMECs遷移抑制作用的機制，本研究對不同濃度TLFA作用下的RMECs采用熒光定量RT－PCR方法檢測了VEGF mRNA的表達。結果發現TLFA能夠下調VEGF mRNA的表達，且隨著TLFA濃度的增加和作用時間的延長，其抑制作用也相應增強。說明TLFA對RMECs中VEGF mRNA表達的抑制作用呈濃度－時間依賴性，抑制VEGF mRNA表達可能是其抑制RMECs遷移的一個重要機制，它可能通過抑制VEGF的表達而抑制視網膜新生血管的形成,從而對DR產生治療作用。

本研究結果表明，除了醛糖還原酶抑制活性之外，TLFA還可以抑制視網膜RMECs中VEGF mRNA表達，從而抑制視網膜新生血管的形成。上述兩種作用機制為其對DR的治療前景提供了理論依據。

【參考文獻】

[1]Shin ES,Sorenson CM,Sheibani N.Diabetes and retinal vascular dysfunction[J].J Ophthalmic Vis Res,2014,9(3)：362-373.

[2]Cai X,McGinnis JF.Diabetic Retinopathy：Animal Models,Therapies,and Perspectives[J].J Diabetes Res,2016：ID 3789217,9 pages.

[3]徐朝暉，趙愛華，高先富，等.牛蒡子降血糖化學成分的研究[J].中國天然藥物，2006，4(6)：444.

[4]Zhaohui Xu,Xiaoyan Wang,Mingmei Zhou,et al.The antidiabetic activity of total lignan from Fructus Arctii against alloxan-induced diabetes in mice and rats[J],Phytotherapy Research,2008,22,97-101.

[5]Zhaohui Xu,Jiaxing Ju,Kai Wang,et al.Evaluation of hypoglycemic activity of total lignans from Fructus Arctii in the spontaneously diabetic Goto-Kakizaki rats[J],Journal of Ethnopharmacology,2014,(151)：548-555.

[6]蔣瑤祁,彭輝燦,肖啟國,等.苦參堿對大鼠RMECs的增生及VEGF表達的影響[J].眼科研究,2008,26(1)：48-52.