環介導等溫擴增技術作為基因快速診斷方法的研究與展望

袁向芬 呂繼洲 吳紹強 王巧黎 趙宏

（1. 中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 100176；2. 青島市中心醫院，青島 266042）

2000年，日本學者Notomi發明了一種新型等溫核酸擴增方法——環介導等溫擴增技術（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）［1］， 經 近20年研究積累，該方法靈敏度高、特異性強、易于操作等優點已被廣泛接受，LAMP亦被認為是一種可有效規避PCR檢測對儀器設備的依賴、行之有效的現場快速篩查技術，并開始應用于病原微生物及物種鑒定、疫病現場檢測、臨床診療等領域。本文結合LAMP技術優勢，對其發展及應用現狀進行了綜述，并對其目前存在的不足、技術群的發展需求和趨勢進行了分析，希望有助于LAMP技術的進一步推廣應用。菜豆花葉壞死病毒［12］等植物病原。此外，LAMP技術還被應用于轉基因大豆［13］等的品系研究，以及中藥人參成分鑒定［14］、奶牛胚胎早期性別鑒定［15］等領域。

1 LAMP技術檢測及應用現狀

LAMP方法與常規的核酸擴增法相比具備其獨特優點：恒溫擴增、高效快速、靈敏度高、特異性強、結果判定簡單，使得LAMP技術成為繼PCR技術后受研究人員青睞的核酸檢測方法之一。

LAMP在細菌檢測方面的研究和應用較廣泛，目前本技術已應用于結核桿菌、肺炎鏈球菌、副溶血性弧菌等多種常見致病菌的檢測，主要原因在于：一方面，細菌的核酸抽提簡單易行，可采用直接煮沸法等方式進行；同時，細菌基因組較為保守，借助LAMP的高效擴增優勢，有助于疫病的快速確診。如Ahmad等［2］建立了一種檢測水中大腸桿菌及檢測水中腸球菌的LAMP檢測方法；Dou等［3］建立了一種檢測腦膜炎的多重芯片LAMP檢測法；Lee等［4］建立了一種檢測血液及乳液中細菌的多重LAMP檢測方法，這些方法均無需復雜的核酸抽提程序，待檢樣品可直接加入LAMP反應試劑中進行擴增，整個檢測過程快速、簡單，非常適用于臨床。相比而言，應用LAMP技術對病毒進行檢測目前多局限于實驗室內研究，缺乏現場應用的主要原因為樣品中病毒含量相對較低且基因易于突變、RNA病毒還極不穩定，現場核酸抽提的得率及純度難以滿足病毒基因檢測需求，但這并不影響LAMP成為PCR技術之后的一種新型的病毒實驗室診斷技術，相關的研究涉及了流感病毒［5］、埃博拉病毒［6］、西尼羅河病毒［7］等人類易感病原，口蹄疫病毒［8］、犬細小病毒［9］、非洲豬瘟病毒［10］等動物病原和玉米萎黃病毒［11］、

2 LAMP技術群研究進展

2.1 核酸物質的快速抽提

核酸抽提是基因檢測的基礎，是分子生物學最關鍵的技術工具之一［16］。LAMP在疫病快速初篩領域的發展，要求配套建立簡單快速且適用于臨床環境的提取方法。目前，常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、異硫氰酸鹽裂解法及離心柱提取法等，多為商品化試劑盒，成本較高，且操作流程繁冗、耗時或需要專業的實驗室設備，并不適合現場檢測。Camp等［17］建立了檢測兩種正布尼亞病毒的LAMP檢測方法，為提高方法的臨床適用性，嘗試跳過核酸純化步驟直接進行LAMP擴增，結果靈敏度下降了100倍，不能滿足高靈敏檢測需求。馮娜等［18］將磁珠法核酸提取與LAMP技術結合，建立了鼠疫桿菌快速檢測方法，其通過“裂解-吸附-洗滌-洗脫”四步驟進行核酸提取，省卻了離心機，操作更為簡單快速。近年來，借助磁分離原理，一些半自動化、自動化核酸提取儀被陸續開發出來，如半自動核酸提取儀（MCB1200，美國思博明）、移液法核酸提取儀（Magtration@12GC，日本PSS）以及高通量磁珠純化儀（KingFisher Flex 96，美國賽默飛）等，實現了核酸提取的自動化、高通量化，節省了人力、時間，已被廣泛應于專業分析實驗室中。Liu等［19］借助FTA（Flinders technology associates）卡，建立了一種快速檢測HIV病毒的RT-LAMP檢測方法，靈敏度可達102個病毒顆粒，FTA卡可快速破裂樣品細胞，緊密結合其釋放的核酸物質，通過洗滌可有效去除樣品中抑制因子，并不會對LAMP擴增效率產生明顯影響，目前亦有相關研究將其應用于分枝桿菌、鼠疫桿菌、瘧原蟲及真菌等［20-22］LAMP檢測方法中。2007年，日本榮研公司（Eiken Chemical）建立了一種簡單快速的結核分枝桿菌LAMP檢測技術［23］，該技術采用了管式DNA快速提取法。待檢樣本經過裂解管內的加熱裂解、吸附管內的核酸吸附、LAMP管內的擴增及紫外燈下判定等過程。所需的裂解液、反應液等均預置于各管中，無需額外添加，通過手動擠壓實現液體在各管間的傳遞，大大減少了污染的可能。日本榮研公司配套研發了專門的一體化儀器，集成了加熱裂解、等溫擴增及紫外觀察等模塊，使檢測更加方便快捷。WHO已正式推薦該方法用于肺結核的臨床診斷中。

然而，直接擴增法會導致靈敏度的下降；磁珠法操作較復雜且提取成本較高；FTA卡僅適用于血液、口腔細胞等細胞水平的樣品，且提取RNA僅可保存7周，日本榮研公司研發的快速核酸提取技術也僅局限于唾液、血清、鼻咽拭子等液體樣品的DNA快速萃取及檢測。因此，探索一種簡單、快速、經濟、適用于現場及多種樣品類型、可同時用于DNA及RNA抽提的核酸提取技術平臺是目前需求所在。筆者建議從以下幾方面進行改進：一是配套快速裂解液的研發，目前常用的裂解液多種多樣，包括胍鹽裂解液、堿性裂解液、酚裂解液等，這些裂解液均可實現核酸物質與蛋白質的迅速分離，有研究對幾種常見核酸裂解液進行了比對，結果顯示胍鹽法及酚氯仿抽提的效果最佳［24］。二是現場快速核酸抽提技術的研發，常規的核酸抽提步驟為裂解、分離、洗滌及洗脫等步驟，多是借助離心機或者磁珠吸附進行的，難以為現場核酸提取使用。亟需研發便攜的現場核酸抽提方法。

2.2 LAMP檢測體系的優化完善

在口岸檢疫、動物疫病監測等工作中，針對單一指標的檢測方法并不利于快速通關或疫情預警，而同時對多重靶標進行檢測分析可有效提升工作效率、降低成本、減少工作量，是一種理想的檢測手段，因此，多重檢測將是LAMP發展的必然趨勢［25］。然而，有研究顯示BST聚合酶具非特異擴增、線性DNA 片段多聚體化等特殊活性［26-28］，使LAMP易出現產物量大、分子量高或仍呈現梯形分布的非特異擴增產物［29-30］，導致反應產物眾多，影響檢測特異性。王彩霞等［31］通過引物設計及篩選，優化建立了一種同時檢測貝類派琴蟲和包納米蟲的雙重LAMP方法，在設計的兩套LAMP引物中引入限制性內切酶位點，通過酶切實現了2 種寄生蟲的鑒別診斷。

分析表明，在60-65℃ LAMP反應條件下，核苷酸鏈處于解鏈和退火的動態平衡狀態，無需外引物的置換作用亦可啟動引物退火。為避免引物數量過多產生的抑制作用，研究者將擴增效率較高的一組或兩組引物的外引物去除，獲得了較好的擴增結果。石素婷［32］針對幾種水生動物疫病建立了一系列LAMP檢測方法，在此基礎上去除外引物，組建了錦鯉皰疹病毒、鯉春病毒雙重LAMP檢測法及流行性造血器官壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒三重LAMP檢測法。

Kasahara等［33］發現在相同條件下，與單重擴增相比，多重擴增時引物擴增速度明顯變慢，推測為引物間的相互抑制作用導致。目前，NEB等生物公司已陸續開發出Bst 2.0、Bst 3.0等通過電腦設計合成的新型Bst聚合酶，相比野生型Bst聚合酶或其大片段，具更強擴增力，有研究表明Bst2.0或Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶擴增速度比野生型快50%左右［34］，可大大縮短反應時間，并且可在一定擴增抑制劑存在情況下或不純樣本中進行擴增，使得LAMP技術更適用于現場快檢。

隨著微流控技術的發展，可通過建立微型芯片，配置多個單獨的反應池來完成多重體系的組建。博奧晶典生物技術有限公司研制出一種圓形的碟式芯片［35］，可實現對同一樣品中24個不同基因靶標的同時檢測，該方法大大降低了時間、人員及試劑耗材投入；24個微室內的反應單獨進行，不會造成相互干擾；無需進行開管操作，不會產生核酸物質污染。類似的設計理念同樣被用來檢測腦膜炎［3］、腸道致病菌［36］等。

2.3 LAMP結果的判定

LAMP擴增結果的判定途徑多樣，除常規電泳法外，還可借助沉淀法、染料法進行，其中，沉淀法利用了DNA合成過程中產生的副產物焦磷酸鎂白色沉淀作為反應標識物，而染料法則利用了染料與核酸的螯合作用，兩種方法均可實現反應結果的可視化判定。

基于防污染的考慮，閉管的判定方式將更適合現場診斷。雖然沉淀法和染料法均可進行肉眼觀察，但存在個體差異導致的視覺誤差，如何放大陰陽性之間差異，是準確判定的前提。染料法有自然光下和紫外光下判定兩種方式，紫外光下，陽性會發射明顯熒光，陰性不發光，大大增加了陰陽性差異，判定更快、更準，紫外法利用一盞手持紫外燈即可實現。另外，袁向芬［37］等對LAMP常用的幾種染料進行了比較篩選，發現目前常用的染料如鈣黃綠素等對LAMP反應具有一定抑制作用，作者篩選到一種核酸染料Dye63，抑制作用更小，并通過多功能酶標儀對反應結果熒光強度進行了讀取，陰陽性熒光強度存在顯著差異，可利用終點法進行準確判定。

橫向流動裝置（Lateral flow device，LFD），即免疫層析試紙條技術亦開始應用于現場可視化快速檢測研究中，該方法所使用的膠體金材料對反應結果具放大作用，使結果觀察更加直觀。Nimitphak等［38］建立了檢測對蝦肝胰腺細小病毒的LAMP-LFD法，可在75 min內完成檢測。研究顯示，LAMP-LFD方法簡單、快速，敏感性接近熒光PCR方法，是一種非常具有潛力的現場診斷技術。LFD法的不足在于無法有效區分非特異性擴增，且需開管檢測，易導致核酸氣溶膠污染。

可見，閉管判定的目視法似乎更適用于臨床初篩，目前，篩選抑制作用更小的核酸染料，設計可準確獲取熒光數據的便攜儀器是該領域的發展方向之一。

2.4 LAMP假陽性結果的規避

LAMP檢測易產生氣溶膠污染導致假陽性結果的問題為其應用中的主要阻礙，也是眾多研究者操作過程中遇到最棘手的問題。實驗室分區操作是大家普遍使用的應對方式，但“治標不治本”，如何從根本上控制污染的產生，是解決這一問題的關鍵。

劉威等［39］使用了一種封閉劑，于反應前加入反應液中，反應過程中封閉劑由固態熔化為液態并封閉于液面之上，減少了氣溶膠揮發。Wang等［40］在引物5′端標記了自避分子識別系統（Self-avoiding molecular recognition systems，SAMRS），可杜絕大多數由引物引起的非特異性擴增，并利用熱敏性尿嘧啶-DNA糖苷酶（AUDG）將預混液中包含的遺留性污染模板去除，建立的錐蟲SAMRS- AUDG-LAMP檢測法反應時長較標準LAMP延長30 min，但并未對反應靈敏度造成影響。

以上方法雖為假陽性問題的解決提供了寶貴經驗，但封閉劑的使用原則上相當于閉管操作，限制了對反應液的進一步分析；而SAMRS- AUDG-LAMP檢測法增加了引物設計及篩選的難度，且一定程度上降低了反應速度。NEB產品說明書中介紹其生產的Bst 2.0 DNA聚合酶完全兼容AUDG法，并不會對擴增速度產生影響，筆者建議可借此來降低交叉污染發生幾率。

2.5 LAMP結果的確診

目前，LAMP結果的確診通常借助限制性內切酶鑒定法進行，可在擴增子內部尋找其特異性酶切位點，或在LAMP內引物內部引入外源性酶切位點，以實現結果的實驗室確診。但酶切鑒定需對反應液進行開蓋操作，這會大大增加氣溶膠污染幾率，另外，該操作需一定實驗室環境，在臨床檢測工作中并不適用。基于這一點，Tone等［41］建立了利用溶解曲線法進行四種病原分析鑒別的LAMP擴增法。其原理在于通過溶解曲線的形狀及峰值對反應產物進行特異性判定。理論上，相同的擴增產物應該具備相同的溶解曲線，序列上微小的不同亦會表現在溶解曲線形狀或峰值的不同上，由此即可確定是否存在非特異性擴增。當然，該方法的實際應用亦須配合現場化的便攜儀器進行。

2.6 LAMP現場診斷一體化平臺

LAMP技術本身及其周邊技術群目前已有了長足發展，然而相關研究廣而雜，各成一家，如何將其有機結合，構建一體化基因快速篩查平臺，實現監測數據及成果共享并對實際工作產生指導作用，這將成為LAMP推廣應用最關鍵的一步。

一體化設計要求我們構建核酸快速抽提、LAMP快速擴增、結果準確判定及數據實時上傳的LAMP快篩平臺，實現LAMP診斷系統化、便攜化、科技化。已有研究成功將LAMP擴增、電泳及后續分析整合在芯片上［42］，運用該芯片可在15 min內完成濃度為23 fg/μL的核酸樣品的LAMP擴增、電泳及判定，其不足在于缺少核酸快速抽提的解決方案，同時存在氣溶膠污染風險；另外，本文涉及的將LAMP技術與各種新技術結合，如防污染法、橫向流動試紙條裝置、新型核酸染料的研發、便攜儀器的開發等，這些技術的綜合應用方能“互補其短，實現共贏”；同時，我們應意識到基因現場快速檢測的目的在于指導進一步工作，因此數據匯總分析及實時上傳也將成為一體化設計的一部分，要求儀器同時具備數據遠程傳輸終端功能，目前，這種終端機的研究與應用也較為廣泛，如用于氣候、水質、疫情的監測及數據匯總等，LAMP現場快速篩查結果亦可通過這種手持終端機進行實時上傳，實現對大數據的綜合匯總分析，并準確指導一系列相關工作。

一體化平臺的構建將為臨床基因檢測工作提供一個高效運轉機制，大大節省人員、時間及物質成本，具有長遠的經濟及社會效益。

3 展望

本文將LAMP技術定位于一種現場基因快檢技術，是因其具備高效、快速、操作簡單等特點，目前，涉及基因現場快速診斷的監測技術平臺仍不完善，是我們亟須解決的一個難題，但可以確定的是LAMP技術等新型核酸擴增技術將成為這種基因快速初篩平臺的關鍵技術。

縱觀LAMP技術發明至今，相關檢測技術已經涉及醫藥、環境、衛生等方方面面，其不斷發展的過程伴隨著不斷與各種新技術的組合優化過程，免疫層析試紙條技術、微流控技術及測序技術等目前較熱的新型技術均可與LAMP技術相輔相成應用于臨床基因診斷中，它的下一步發展仍需要研究者不斷的探索與創新，真正建立現場基因診斷一體化平臺，使其應用不再受時間、地點、操作人員等條件的限制，任重而道遠！