循環腫瘤細胞在結直腸癌治療中的研究現狀

張文杰，張冰凱，董朔暉，董 浩，劉增林，鄭文博，張 翔，王延磊，胡三元，戴 勇

(山東大學齊魯醫院，山東 濟南，250012)

隨著發病率、死亡率的上升，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)于2016年已成為導致死亡的第三大癌癥[1]。因手術、放療、化療及靶向治療的應用，CRC患者的5年、10年生存率達到了65%與58%[2]。即使這樣，晚期CRC患者依然容易發生遠處轉移[3]。多項研究表明，50%～60%的CRC患者在疾病進展過程中會出現遠處器官轉移[4-5]。復發、轉移依然是CRC患者死亡的首要原因。因此，CRC治療的關鍵是找到能早期發現疾病并可監測疾病進展的方法[6]。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)被認為是癌癥患者的一種實時“液體活組織”，可反映疾病進展與預后[7]。一項納入15個臨床研究共3 129例病例的薈萃分析表明，不論采用何種檢測方法，外周血CTCs陽性預示CRC患者更差的總生存期(overall survival，OS)[風險比(hazard ratio，HR)＝2.36，95%置信區間(confidence interval，CI)：1.87-2.97，P＝0.006)]及無進展生存期(progression-free survival，PFS)(HR＝1.83，95%CI：1.42-2.36，P＜0.00001)[8]。 此外，單純 CTCs計數不足以反映腫瘤的異質性狀況，研究發現[9]，CTCs可分為不同的亞群，其中間充質CTCs可作為評估腫瘤進展的生物標志物。另有研究表明[10]，部分CTCs表達腫瘤干細胞標記物，在腫瘤形成過程中扮演循環腫瘤干細胞(circulating tumor stem cells，CTSCs)的角色。

1 腫瘤轉移與CTCs的形成

部分原發腫瘤細胞經歷上皮間質轉化等過程獲得高侵襲性，從原發組織脫落，侵入周圍基質并進入血液循環，成為CTCs。大多數CTCs被機體免疫系統殺死，僅極少數轉移傾向極高的CTCs存活下來，并可相互聚集形成循環腫瘤微栓。幸存的CTCs或循環腫瘤微栓離開血液循環，進入到繼發臟器的局部微環境，進而逃避宿主的局部非特異免疫殺傷作用，在各類生長因子的作用下增殖生長并最終形成轉移灶[11]。

CTCs被認為在腫瘤轉移過程中發揮重要作用。有學者創造性地建立了CRC的原位小鼠模型來發展轉移并獲取CTCs。獲取的CTCs成功地在體外進行了培養，并將培養的CTCs重新注入小鼠體內，發現在注射部位迅速生長出了腫瘤，表明CTCs的腫瘤形成能力。同時，他們對這個細胞系的表達譜進行分析，發現與細胞間粘附相關的基因claudin-7、CD166顯著下調，表明與來自肝轉移瘤的大量腫瘤細胞相比，CTCs更具有轉移表型；干細胞標志物 DLG7、BMI1在CTCs中顯著上調，這與CTCs更強的腫瘤形成及自我更新能力密切相關。這些發現表明了小鼠來源的CTCs參與腫瘤轉移[12]。

2 CTCs的檢測技術

2.1 基于化學性質進行富集的檢測方法 CellSearch系統是利用上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molcule，Ep-CAM)標記磁珠對上皮細胞進行富集，細胞經固定后用4，6-二脒基-2-苯基吲哚[2-(4-amidinophenyl)-6-indole carbamidine dihydrochloride，DAPI]熒光染料標記細胞核，CD45熒光抗體及CK8、CK18、CK19或CKmix熒光抗體標記細胞，結果分析在四色熒光顯微鏡下進行。將DAPI+、CD45-、CK+及Ep-CAM+的細胞定義為CTCs。CellSearch系統的優點是細胞形態結構能較好地保存，即熒光顯微鏡不但能看到熒光染色的結果，還能觀察腫瘤細胞的形態，且已有商品化的半自動檢測儀器簡化操作過程。缺點是采用上皮細胞標志篩選將遺漏發生上皮間質轉化的腫瘤細胞，檢測結果具有較高的假陰性率[13]。

LiquidBiopsy 平 臺(Cynvenio Biosystems，Westlake Village，CA，USA)通過最初與 DAPI、CK、CD45 抗體、Ep-CAM-生物素抗體進行差異性免疫染色來富集CTCs，再加入生物素蛋白-鐵磁流體抗體用于磁固定，再使用高通量基因測序進一步分析。其優點是能處理相對大量的血液樣本，特定腫瘤細胞的捕獲率可達到70%以上，純度可達10%，同時可集成到實驗室流程中，實現CTCs計數并提供高純度樣品用于分子分析。但由于采用了與CellSearch系統類似的檢測原理，仍存在假陰性率較高的問題[14]。

Epic 系統(Epic Sciences Inc.，San Diego，CA，USA)除紅細胞裂解外沒有富集步驟。所有有核細胞沉積在載玻片上，再進行差異免疫染色鑒別CTCs。由于考慮到上皮間質轉化、循環腫瘤微栓、凋亡的存在，Epic系統一定程度上解決了假陰性率問題，在驗證性試驗中體現了比較好的敏感性、特異性及線性，除了同樣可整合熒光原位雜交技術、高通量基因測序等下游功能，此系統一個重要特征是具有患者載玻片的生物儲存庫的能力，可用于回顧性生物標記分析[15]。

Saucedo-Zeni等[16]已發明了基于Ep-CAM抗體標記原理的醫療器械，僅需將其放置于外周靜脈中即可于體內對CTCs進行初篩，然后將初篩的CTCs在體外進一步鑒別；其優點是克服了少量血液樣本中CTCs稀少難以富集的困難，可在全身血液中捕獲CTCs，提高了富集效率。

2.2 基于物理性質進行富集的檢測方法 ISET(RareCells Diagnostics，Paris，France)利用CTCs的較大尺寸及更多結構剛性的特性進行富集。其核心部件是一個過濾器，過濾器內分布有一定直徑的濾孔濾膜，最后根據形態特征對富集的CTCs進行鑒別。相較實時聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)，ISET 具有更高的靈敏度，所需血液標本的量更少，結合免疫細胞化學、免疫熒光等下游功能，可對CTCs進行更深入的分析[17]。

Parsortix平臺(ANGLE plc，Guildford，UK)采用微流體原理，不僅考慮到了富集過程中CTCs的大小特性，對其變形能力也有一定考量。通過對富集的CTCs進行免疫組化鑒定，發現該平臺對于不同來源腫瘤細胞的捕獲率為42%～70%，純度約1%。可貴的是，經過分離獲得CTCs，99%是有活性的。與CellSearch系統相比，兩者在CTCs捕獲率方面差異無統計學意義[18]。

FMSA 系統(Pennsylvania State University，Department of Biomedical Engineering，State College，PA，USA)是一種新型靈活微型彈簧陣列裝置，與以前的微過濾裝置不同，微型彈簧陣列的柔性結構可最大限度地減少細胞損傷，以保存活力，同時最大限度地提高過濾速度。其平均捕獲率為90%，存活率高于80%，在與CellSearch系統的對比試驗中，FMSA系統顯示出更高的靈敏度[19]。

OncoQuick系統(Greiner Bio-One International GmbH，Germany)采用物理過濾原理的同時進行密度梯度離心來分離CTCs，再采用RT-PCR進行鑒定。這種新密度梯度離心法與標準方法Ficoll相比，OncoQuick顯著提高了純度，腫瘤細胞捕獲率也有一定程度的提高[20]。

AccuCyte系統(RareCyte，Seattle，WA，USA)則采用了將密度離心、免疫染色及全外顯子測序結合起來的設計思路，AccuCyte系統可提供高分辨率圖像，通過形態、表型特征識別CTCs，捕獲率為90%～91%。在某些血液標本中，其捕獲的CTCs數量顯著高于CellSearch系統[21]。

DEPArray系統(Menarini Silicon Biosystems，Castel Maggiore，Italy)利用 CTCs獨特的電性質，采用雙電流技術對CTCs進行檢測。此技術需要預先使用OncoQuick系統對CTCs進行富集，捕獲率受目標細胞數量影響，為11.6～86.0%[22]。

聲學分離是利用細胞尺寸、可壓縮性差異來分離不同的細胞類型[23]。有研究人員設計的聲學流式細胞儀已實現從血液中高通量分離CTCs，其捕獲率超過83%，可去除90%以上的雜質細胞，同時對細胞活力沒有顯著影響[24]。

3 CTCs在CRC治療中的作用

最近，一項納入12項通過RT-PCR檢測外周血CTCs的臨床研究共2 363例非轉移性CRC患者的薈萃分析表明，不管何種TNM分期、何時進行采樣、是否進行新輔助治療，CTCs陽性均意味著更差的 OS(HR＝3.07，95%CI：2.05-4.624，P＜0.001)與PFS(HR＝ 2.58，95%CI：2.00-3.32，P＜0.001)。 同時，區域淋巴結轉移(RR＝1.62，95%CI：1.17-2.23，P＝0.003)、浸潤深度(RR＝1.41，95%CI：1.03-1.92，P＝0.03)、血管侵犯(RR＝1.66，95%CI：1.17-2.36，P＝0.004)、腫瘤級別(RR＝1.19，95%CI：1.02-1.40，P＝0.029)、TNM 分期(RR＝0.76，95%CI：0.71-0.81，P＜0.001)與 CTCs陽性密切相關。這些證據表明，與影像學相比，CTCs的臨床應用價值在于可更早地預測腫瘤轉移[25]。同時Zhao等[26]發現，腸系膜下靜脈血中檢測到的CTCs較外周血更多，表明肝臟可減少CTCs的數量。Wind等[27]進一步發現，與術前相比，術中CTCs的檢出率、數量顯著增加，并且腹腔鏡手術中檢測到的CTCs少于開腹手術[27]。Zhao等還發現CTCs陽性患者往往伴隨血清CEA、CA19-9水平升高。即使在非轉移性CRC患者外周血幾乎檢測不到的CTCs的情況下，血清CA19-9與腸系膜下靜脈CTCs水平也呈現相關性。這些結果表明，在腸系膜下靜脈使用CellSearch系統檢測CTCs更具有臨床意義，血清CA19-9水平可幫助進一步評估腸系膜下靜脈CTCs水平[26]。不同于CA19-9，Ki67指數對CRC患者預后的提示作用獨立于CTCs計數[28]。

對于轉移性結直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)患者，Kaifi等[29]發現肝腫瘤負荷越大，血清CEA水平越高，檢測到的CTCs數量越多[29]。但Das等[30]的研究表明，CTCs計數與肝肺轉移瘤沒有關系，這項基于21例mCRC患者的聯合化療實驗還發現，11例開始化療后立即出現CTCs計數下降，5例化療結束時與基線水平相比CTCs計數下降，這提示我們CTCs聯合血清CEA有助于評估化療mCRC患者的化療反應。多藥聯合對晚期CRC仍然有效，但會使化療產生的副作用明顯增加，CTCs計數可識別可能獲益更多的患者，避免對無獲益者采取高毒性方案[31]。在基因層面，原發腫瘤與CTCs的KRAS突變水平是一致的，當原發腫瘤難以獲得時，CTCs可作為替代選擇，甚至可更精確地動態預測mCRC患者對靶向治療的反應[32-33]。一項納入38例接受西妥昔單抗或帕尼單抗治療的mCRC患者的前瞻性研究分別在基線(治療前)、早期(治療后2～4周)及晚期(治療后8～10周)測定CTCs水平，發現早期CTCs陽性與陰性患者的PFS(中位數，2.0 vs.4.0個月，P＝0.004)、OS(4.7 vs.11.4，P＝0.039)差異有統計學意義，治療期間CTCs的變化情況是PFS、OS的獨立預測因素，其對靶向治療反應的評估作用早于影像學檢查[34]。雖然西妥昔單抗的治療原理是基于表皮生長因子受體，但有研究顯示[35]，表皮生長因子受體在CTCs中是否表達對靶向治療反應的影響差異無統計學意義。

CTCs作為CRC患者預后的獨立預測因子正得到越來越多的接受，但多數用于檢測CTCs的技術顯示出低靈敏度、特異性。因此，Chen等[36]試圖找到CTCs的替代標記物。他們從90例CRC患者、151例健康志愿者的1.5 mL外周血中所含的CTCs直接提取RNA，然后通過RT-PCR篩選候選標記基因，成功鑒定了上皮細胞轉化序列2基因具有高差異表達比率(P＜0.01)。上皮細胞轉化序列2基因顯示出良好的靈敏度與特異性，可作為替代的測量方法彌補目前CTCs檢測在CRC患者診斷與監測中的不足。

4 CTCs亞群及CTSCs與CRC

雖然CTCs計數作為CRC進展及治療反應的潛在標記物已被廣泛接受，但對這些細胞異質性缺乏認識已成為將其應用于臨床的瓶頸。Cui等[9]根據上皮細胞、間質細胞標志物的表達情況，將CTCs分為上皮型、混合型、間質型，發現在CRC患者中，間質型隨著腫瘤進展而顯著增加，且間質型陽性與CRC患者遠處轉移的發生顯著相關。Malara等[37]則將結腸癌患者血液中分離出的CTCs分為CTSCs亞群(CD45-CD133+)、循環分化細胞(趨化因子受體4亞群+CK20+)。生存分析結果表明，CTSCs亞群對應更差的OS，而循環分化細胞亞群則對應更差的PFS。對于CD26+CD326-的CTCs亞群，有研究發現CRC患者術前高水平的CD26+CD326-的CTCs正確預測了44.4%的腫瘤復發，而術后高水平的CD26+CD326-的CTCs正確預測了69%的腫瘤復發，準確性為88.8%。相比之下，術后CD26+CD326-的CTCs陰性患者的三年無進展生存率增加86%，同時腫瘤復發風險降低大于90%。因此，CD26+CD326-的CTCs可作為CRC復發的獨立預后因子[38]。

CTSCs代表了基于其干細胞特性、侵入性而具有轉移起始能力的CTCs獨特亞群，因此對于CRC患者的預后是至關重要的。Grillet等建立多個體外CTCs細胞系，發現所有CTCs細胞系在皮下異種移植物中是致瘤性的，并且在脾內注射后也能定植于肝臟。雖然CTCs在血細胞中很少，但在遺傳、表型上是異質的。對單克隆的CTCs進行分析，其中部分單克隆系仍呈現異質性并高表達CTSCs標記，直接表明CRC患者來源的部分CTCs具有CTSCs的所有功能屬性。同時，與化療藥物抗性相關的基因也呈高表達狀態，藥物敏感性試驗發現不同細胞系的藥物敏感性存在差異，這強烈提示我們CRC患者需要個性化治療[39]。與非致瘤性的CTCs相比，CTSCs不僅能從原發性腫瘤脫落，而且能逃避免疫監視，在循環血液中存活并隨后在遠處器官中形成轉移。因此，CTSCs可能是預防CRC進展的潛在治療靶點[40]。目前報道的主要 CTSCs標志物包括 CD133、CD44、CD166、Ep-CAM、CD24、CD26、CD29、ALDH1 等。 盡管不同的細胞表面標記已用于表征與分離CTSCs，但迄今尚無鑒定CTSCs的良好標記物。Meng等[41]發現，與傳統 CD133+或 CD44+的CTCs細胞相比，CD262+的CTCs在培養的腫瘤球體中形成更多的腫瘤球，表現出更高的化學耐受性，在裸鼠中移植后發生腫瘤的比例更高，并且發生遠端轉移瘤的頻率更高。此外，當皮下移植CD262+的CTCs細胞時，在循環中能更頻繁地檢測到CTCs。研究發現，Ⅲ期CRC CTCs中CD44變體外顯子9陰性患者的5年生存率為89%，而陽性表達患者的5年生存率為52.4%(P＜0.05)。對于Ⅳ期不可切除的CRC患者而言，CD44變體外顯子9陰性表達患者的2年生存率為70.1%，而陽性表達患者的 2年生存率為 33.3%(P＜0.05)[42]。Fang等[43]發現聯合影像學、血清 CEA水平及CD133+、CD44+、CD54+的CTCs檢測可提高CRC肝轉移檢出率，靈敏度為 88.2%，特異度為 92.4%。 同時，CD133+、CD44+、CD54+的CTCs高表達意味著更短的生存期，其對預后的提示作用在肝轉移瘤無法切除的CRC患者中更明顯[44]。不同于CTCs，CTSCs(CD133+Ep-CAM+)數量在肝門靜脈血、外周血中的差異無統計學意義，因此，我們可能無法從門脈系統中獲取更多的CTSCs[45]。

CRC中CTCs的檢測有助于腫瘤的早期診斷及預后判斷，同時還可用于抗腫瘤藥物的療效評估及制定個體化治療方案，是一種具有高度可行性及可重復性的非侵入性新型診斷工具。目前阻礙我們深入認識CTCs的兩個重要障礙是它們的稀缺性與異質性。越來越多的新方法使CTCs的富集效率大大提高，新的標記物組合有效降低了假陽性率、假陰性率，但仍難以覆蓋隨疾病進展不斷發生縱向變化的所有CTCs，期待更加完善的檢測方法。同時，越來越多的證據表明CTCs動態異質性的存在，僅僅依據CTCs計數無法對CRC進行全面而精確的評估，不同CTCs亞群在CRC發生與發展過程中扮演著不同的角色。CTSCs作為具有干細胞特性的獨特亞群，其作用不言而喻，可能是早期發現、阻斷腫瘤發生與轉移的關鍵。相較CTCs，更加稀缺且更加神秘的CTSCs吸引著我們去揭開其神秘的面紗，多種標志物組合仍是鑒別CTSCs的主要手段。CTCs體外模型的建立不僅為CTCs及CTSCs研究開辟了更廣闊的空間，而且為CRC患者制定個體化治療方案提供了無限可能。總之，基于CTCs的個體化、實時性治療會是CTCs應用于CRC治療的發展趨勢。