CRISPR技術的發展及應用研究進展

梁麗琴 閻婧 張鑫 郝澤婷 段江燕

（山西師范大學生命科學學院，臨汾 041004）

1 CRISPR 概述——從發現到應用過程

CRISPR是細菌及古細菌中的一種基于RNA的后天免疫防御系統（Clustered regularly interspersed short palindromic repeats）［1］。CRISPR可利用導向RNA指導Cas蛋白（CRISPR-associated proteins）對目的基因組進行修飾，其結構包括3部分：5'端的反式激活核糖核酸基因，中間部分的Cas蛋白結構基因和3'端的CRISPR基因座，反式激活核糖核酸基因表達產生的tracrRNA和CRISPR基因表達產生的crRNA組成二元復合體，能夠引導Cas蛋白識別切割目標位點［2］。Barrangou等［3］發現噬菌體入侵后，細菌利用CRISPR系統整合來自噬菌體的基因組，并改變自身的細胞表型的抵抗性，用以抵抗入侵的噬菌體，而且這種抵抗特異性取決于整合序列的相似性。2008年，Marraffini等［4］首次通過實驗在葡萄球菌中驗證了這種功能。所謂結構決定功能，加州大學UCB人員報告了兩種主要的Cas9蛋白子型晶體結構，進而揭示了所有Cas9家庭成員的結構核心［5］，這對后期理解CRISPR的作用機理具有重要意義。

到2012年，CRISPR這個新型基因組定向編輯系統基本成型，并首次登上歷史舞臺［6-8］，與ZFN、TALEN相比，該系統由導向RNA識別靶位點，簡單，精確，高效。形象地說，其精確度幾乎與word文檔中的“查找替換”功能相當。隨著CRISPR的不斷發展，現已應用于體外培養的細胞［7-8］和各種不同的模式生物中，從將其應用于小鼠［9-10］、細菌［11］、真菌［12］、斑馬魚［13］，到實現在植物中的基因組編輯［14］，如對西紅柿品種的改良［15］以及編輯棉花耐鹽相關的內源基因［16］，再到對人類細胞的基因組編輯［8］，同時也證實了該技術在高等靈長類動物中的可應用性［17］，近兩年在豬、猴等大型動物中實現靶向基因編輯并成功構建動物模型、細胞模型應用于醫學。2017年，來自密歇根州立大學等機構的研究人員首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對獼猴胚胎進行了編輯［18］。最近，科學家使用CRISPR技術編碼細菌DNA中的信息，這是CRISPR技術首次被用于向DNA中寫入數據［19］。基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜志列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視?？梢哉f，短短幾年CRISPR基因編輯技術迅速席卷了從基礎科學研究到農業育種及基因治療的各個領域。

2 CRISPR技術的改進歷程

隨著CRISPR的不斷發展，該技術不僅可以編輯基因組中的單個基因，也可以對不同的基因位點同時進行編輯。不僅能對DNA編輯，也首次實現了對RNA的編輯。2016年4月，來自美國加州大學的研究人員從改變CRISPR/Cas9系統的角度出發，設計了PAMmer短核酸片段與gRNA一起引導Cas9靶向RNA。經檢驗，該系統成功地靶向編碼蛋白ACTB、TFRC和CCNA2的RNA［20］。這一發現使得不需要使用人工標記就能實現一段時間內在活細胞中追蹤RNA，保證了正常的細胞過程。之后，科學家發現了幾種新型的CRISPR酶，它們是CRISPR蛋白-Cas13a突變體，這些酶如果被激活就像“吃豆人”一樣能夠“嚼碎”RNA，因此這些酶類或許能作為診斷傳染性病毒的敏感檢測器［21-22］。但CRISPR本身在應用中顯得不盡完美，科學家不斷致力于完善CRISPR本身，以提高該技術的精確性和有效性。

傳統的CRISPR是利用Cas9蛋白對目標基因進行切割，2013年首次報道的基于標準系統的CRISPRi（CRISPR interference）能夠精確有效和可逆地抑制基因表達，它使用的是由兩種蛋白組分形成的融合蛋白：可經強力霉素（Doxycycline）誘導而失活的Cas9蛋白（dCas9）和KRAB蛋白的抑制結構域［23］。2016 年，Mandegar等［24］首次利用CRISPRi抑制了人類誘導多能干細胞（iPSCs）基因的表達：先將編碼dCas9的基因和編碼KRAB抑制結構域的基因融合，形成融合基因dCas9-KRAB的抑制基因，將該融合基因導到病毒載體上，并導入宿主細胞（如iPSCs和源自iPSCs的心肌細胞）使其表達，產生的融合蛋白停留在基因組靶位點上并抑制基因表達而無需切割DNA。盡管CRISPRi暫時地抑制基因表達確實比標準系統精確高效，但真正應用到基因治療領域則必須考慮病毒載體的可實施性。2015年9月，CRISPR領頭人之一張鋒發現了一種迄今為止最為簡單的CRISPR系統——CRISPR/Cpf，酶Cpf1來自弗朗西斯氏菌，具有雙重切割功能：能切割DNA，也能切割RNA。利用Cpf1切割crRNA前體發夾結構上游從而產生成熟的crRNA，成熟的crRNA引導酶Cpf1特異性地靶向目標序列［25］，顯而易見，這個過程并不需要tracrRNA分子的幫助。因此，CRISPR/Cpf比CRISPR/Cas9更為簡單，比CRISPRi應用更廣泛。并且，在2016年6月的一項新研究中，使用Cpf1蛋白家族中編輯效率最高的AsCpf1和LbCpf1開展Degenome-seq測試結果表明，CRISPR/Cpf 幾乎沒有脫靶效應［26］，這更證明了相比于Cas9，Cpf更優越。

2015年11月，Bolukbasi等［27］科學家將程序化的DNA結合結構域pDBD融入CRISPR/Cas9系統，從而衰減Cas9固有的DNA結合蛋白親和力，結果表明，這種可調控的Cas9-pDBD嵌合體可以提高約100倍的精確性。同年12月，來自美國德州理工大學健康科學中心的研究人員通過將雙鏈延伸約5 bp、改變胸腺嘧啶到胞嘧啶或鳥嘌呤的連續序列的第4個胸腺嘧啶等方法優化sgRNA，使CRISPR基因敲除能力提高50%［28］。也有科學家通過使用PAM經過修飾的金黃色葡萄球菌，測試擴寬靶點范圍后CRISPR的效果，從而改變該技術的準確性，而且這種改變PAM的特異性不需要結構信息，因此對于Cas9 直系同源物具有廣泛的適用性［29］。在一項新的研究中，科學家將一種脫氨酶引入CRISPR/Cas9系統，這樣引起DNA單個核苷酸的變化可避免產生有害的雙鏈斷裂［30］。2017年，科學家默克研發了一種新型基因組編輯技術，名為“proxy-CRISPR”，它能夠覆蓋先前無法到達的基因組區域，使得CRISPR變得更加高效、靈活和具有特征性［31］。這些研究結果表明，通過對PAM、sgRNA、核酶等方面的研究，CRISPR技術局限性在不斷改進和完善。

除此之外，也有科學家從研究CRISPR的精細結構和作用機制出發來改進該系統。美國加州大學的科學家利用X射線晶體衍射對CRISPR/Cas9剪切DNA的過程進行了更深入地觀察，在捕獲Cas9蛋白進行DNA編輯時的3D圖像之后，發現Cas9會使DNA螺旋發生彎曲30°，為R環的形成提供了所需的變形結構。理解CRISPR在作用過程中R環的形成原因，可以幫助避免對DNA鏈進行錯誤剪切［32］。在細菌中，CRISPR識別并作用于外源DNA，從而阻止它對細菌細胞的破壞。而大腸桿菌是如何區分該細菌自身和外來遺傳物質的，Hayes等［33］科學家構建了大腸桿菌的CRISPR相關抗病毒防御復合體識別病毒遺傳物質時的結構圖，解釋了其作用機制。以上這些研究對于提高CRISPR的準確性、解決CRISPR的靶向錯誤以及治療臨床疾病都具有重要意義。

與捕獲外源DNA的CRISPR系統十分類似，研究人員還發現細菌能夠利用RT-Cas1融合蛋白，以一種依賴于RT（逆轉錄酶）的方式在體內獲得外源RNA，RT-Cas1和Cas2能夠在體外將該 RNA整合到細菌本身的CRISPR序列中，有望將該系統轉入有機體內作為病毒檢測器使用［34］。此外，加拿大戴爾豪斯大學醫學院Dellaire博士首次證實在非分裂細胞中進行基因編輯確實是可能的［35］。第一個CRISPR編輯的有機體——工程化蘑菇也已經開始種植并售賣［36］等，這些研究無疑將CRISPR的發展推到了一個新的高度。

盡管CRISPR技術廣泛應用于各大領域，但是它同時也存在著“脫靶效應”這個科學家一直以來攻克的難題。2016年初，在CRISPR 共同體會議上（Creating a CRISPR Community），美國馬薩諸塞州總醫院和哈佛醫學院的Keith Joung等對Cas9蛋白進行了多種改造，最終將其靶向錯誤下調到探測限制之下。Caribou Biosciences CEO Rachel Haurwitz也報告了一種由Caribou Biosciences與DuPont Pioneer合作開發的新型基因組水平無偏技術，用于探測CRISPR的靶向錯誤，期待該技術能提高CRISPR的有效性。近日，兩種分析CRISPR/Cas9基因組編輯脫靶效應的新方法發表在了期刊Nature Methods上［37-38］。研究人員發現了兩個CRISPR“關閉開關”：AcrllA2和AcrllA4，其中AcrllA4能將脫靶效應減少4倍，它們能夠對Cas9酶發揮抑制作用，阻礙了它的活性，有效降低了脫靶效應［39-40］。此外，Cas9靶向人類細胞精確性的證實對于基因治療和細胞療法的發展也有很大的推動作用［41］?；诙嘀谼igenome-seq（Digested genome sequencing）的工具，近日被科學家發現能同時繪制高達11種Cas9核酸酶的全基因組特異性，發現想要的和不想要的插入和缺失，節約了時間，降低了成本［42］。

3 CRISPR技術在基因治療及醫學領域方面的應用

多年來，血液病、腫瘤、遺傳病等疾病一直是醫學界的研究難題，而CRISPR無疑推動了基因治療攻克這些疾病的進程。移植器官的短缺一直是治療器官衰竭的主要障礙，豬是異種供體最理想的動物，但內源性逆轉錄病毒（一種致癌病毒）的存在卻成了器官移植路上的絆腳石。2015年11月，中國留學生楊璐菡領導的研究團隊利用CRISPR清除了豬基因組中的這些致癌的病毒基因。他們首先確定了PK15（豬腎上皮細胞系）逆轉錄病毒的拷貝數是62，然后使用CRISPR滅活了這些病毒基因，并且通過實驗證明消除這些病毒基因對于這種器官移植帶來的傳染性降低至少1 000倍［43］，此項研究掃清了豬器官用于人體移植的重大障礙，大大提高了異種移植在臨床上應用上的可能性，因此被稱為 “基因工程的壯舉”。而另一種疾病，由抗肌萎縮蛋白基因的突變造成的杜氏肌肉營養不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD），也是一個極具毀滅性的疾病，始終困擾著醫學界。2016年，研究者在患杜氏肌肉營養不良癥的小鼠模型中利用CRISPR敲除有缺陷的基因，恢復了肌營養不良蛋白的表達，成功治愈杜氏營養不良［44-46］，這標志著首次利用CRISPR成功實現對遺傳病動物出生后的基因治療，給此病的患者帶來了希望。通過直接糾正致病突變，基因編輯技術CRISPR/Cas9表現出了治療遺傳疾病的重大潛能。研究人員通過研究利用該技術幫助治療鐮刀形細胞病和β地中海貧血癥［47］。2017年，科學家利用CRISPR/Cas9技術，敲除視細胞上Nrl與Nr2e3這兩個基因來幫助患者擺脫失明的陰影［48］。中國科學家發現無論在體外還是體內，CRISPR都能抑制HBV的表達，邁出了利用CRISPR治療HBV的第一步［49］。之后，研究人員發現利用“基因魔剪”CRISPR/Cas9成功地在活體動物基因組中切除HIV-1 DNA片段，完全關閉了HIV-1的復制，從而消除HBV引發的后期感染，這項研究加速了CRISPR治療 HBV 的進程［50-51］。

科學家Paquet等［52］成功利用CRISPR技術構建出細胞疾病模型，在細胞中重現了疾病發生的過程，研究者報告了一種基于CRISPR的基因組編輯框架，能夠高效精確且有選擇性地引入等位基因序列從而引起改變，并且建立“Correct”這種方式來實現無痕基因組編輯，該技術可以高效精確地將致病基因導入細胞中從而獲取細胞模型進行更深入地研究，為基因療法提供了新視角。

除此之外，杜克大學的科學家們利用CRISPR/Cas9技術將小鼠結締組織中分離出的細胞直接轉化成了神經元細胞。他們是利用CRISPR的修改版直接啟動已經存在于基因組中的天然拷貝。這種方法產生的神經元細胞比以往更完整而持久，有望用于神經疾病的建模并開發新療法［53-54］。2016年8月，美國康奈爾大學、中南大學湘雅醫院等機構的科學家利用人胚胎干細胞（Human embryonic stem cells，hESCs）平臺和高通量藥物/小分子化合物平臺，與新型基因打靶技術CRISPR、新一代RNA測序技術以及hESCs定向胰島β細胞分化技術結合，在全球首次完成了2型糖尿病易感基因在hESCs定向胰島β細胞分化過程中的相關功能驗證，并闡述了這些基因在2型糖尿病中的部分機制［54-55］。科學家們還利用基因編輯技術改造小鼠干細胞，使得它們能夠抵抗關節炎和其他的慢性疾病導致的炎癥［56］。基于CRISPR/Cas9技術，科學家發明了一種同源非依賴性靶向插入技術（Homology-independent targeting insertion，HITI），該技術是一種全新的、可應用于基礎研究和臨床治療的基因編輯方法。這種技術能夠部分恢復失明的嚙齒類動物的視覺反應，為治療多種視網膜疾病、心臟疾病和神經疾病等方法打開新的途徑［57］。2016年科學家利用CRISPR/Cas9編輯小鼠胚胎干細胞，解釋了一種類型的lncRNA（Long non-coding RNA）與細胞內的蛋白質相互作用的過程，從而控制心肌細胞的發展［58］。2016年8月，美國麻省理工學院的研究人員首次利用CRISPR/Cas9讓人細胞變身為記憶存儲系統［59］。2017年2月，西奈山伊坎醫學院的研究人員創建了一種能夠展示從正常血細胞到白血病一步步進展的新模型?？茖W家們是利用CRISPR技術將來自骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病患者的血細胞轉變成誘導多功能干細胞。這類干細胞能夠模擬疾病從健康狀態到白血病的所有階段［54，60］。2017年1月，Salk研究所的科學家小組利用CRISPR技術首次成功培育出了人-豬嵌合體胚胎，這是干細胞研究領域的一個里程碑［54，61］。同年7月，中國科學家首次將基因編輯技術用于干細胞的遺傳增強，宣布了國際上第一例遺傳增強人類干細胞（Genetically enhanced stem cells，GES細胞）的誕生。所謂遺傳指的是這種基因組上的改變在干細胞分裂的過程中，能夠穩定地傳遞給子細胞，而增強指的是經過這一微小的遺傳密碼的改變，干細胞會“老”的更慢，可以在患者體內存活更長時間，產生更好的再生治療效果［62］。CRISPR作為基因編輯領域的一項新技術，它對醫學領域的貢獻可以說是百花齊放，碩果累累。

基于CRISPR，癌癥的治療也在不斷取得突破性進展。2015年，研究者首次在一個癌癥動物模型中系統地“敲除”了整個基因組的所有基因，揭示了與腫瘤進化和轉移相關的一些基因［63］，可以說，這是利用CRISPR在體內鑒別癌癥和其他復雜疾病相關基因的重要一步。2016年，科學家利用CRISPR/Cas9技術和特殊的DNA條形碼（DNA barcodes）設計了一種用于描述和追蹤含感興趣突變的癌細胞亞群情況的方法。研究人員利用這一技術模擬了肺癌細胞抵抗EGFR抑制劑的不同機制。CRISPR-barcoding可以對大多數類型的遺傳修飾進行調查，是一種簡單且高度靈活的方法，有望促進對特定突變的功能研究［64］。2017年，來自匹茲堡大學醫學院的研究人員利用CRISPR基因編輯技術有效靶向作用促癌“融合基因”，改善了惡性肝癌和前列腺癌小鼠模型的生存率［65］。科學家還利用CRISPR基因編輯系統對小鼠進行研究發現，小鼠機體中或許能夠產生和人類機體腫瘤非常相似的結腸腫瘤，相關研究或許能幫助科學家闡明疾病進展的分子機制以及開發新型的治療方法［66-67］。

4 CRISPR前景及展望

CRISPR技術自出現就受到廣泛關注，已成為新時代科學研究領域的有力工具。目前，盡管對其功能和作用機理進行了諸多研究，以優化CRISPR系統從而提高它的有效性和特異性，但是仍然存在一些不足之處，如20 bp的識別位點的特異性有限，可能造成較高的脫靶效應，最終導致嚴重后果，如引發癌癥等。且在 Cas9系統中，切割位點必須含有前間區序列鄰近基序（Protospacer adjacent motif，PAM），限制了對任意序列的切割。此外，gRNA容易形成二級結構等等都對該技術都有一定的局限性，這些都需要進行更深層次地研究。

未來CRISPR 系統研究重點依然在于降低脫靶率，提高其特異性和精確性，可以從優化sgRNA結構、脫靶檢測方法、改造Cas9蛋白或尋找更合適的蛋白等方面入手。河北科技大學的韓春雨團隊在2016年發現了類似于Cas9的Ago蛋白家族的內切酶也能利用寡核苷酸作為向導來降解入侵的基因組，這種NgAgo-gDNA 系統不像Cas9系統需要PAM序列，結果表明這種方法無靶向不匹配而且能高效編輯富含G+C的目標基因組。同時，韓春雨指出，Argonaute家族有很多可能做基因編輯的蛋白質［68］。這項重大發現可以說是轟動了整個世界，許多科學家和學者對這一發明產生了好奇，紛紛在各大實驗室展開重復實驗。有些實驗室成功復制了這一實驗，但也有許多科學家無法成功復制這一偉大的發現，于是這項研究一直飽受爭議。近日一個中國研究團隊發表了一項關于NgAgo的新成果，證明了NgAgo-gDNA能夠通過促進pgRNA（Peregenomic RNA）的降解有效抑制乙肝病毒的復制，但他們沒有檢測到NgAgo有任何DNA編輯的能力［69］。2017年8月2日，因被眾多科學人員質疑，韓春雨團隊主動要求撤稿。而韓春雨表示這項技術的確在自己的實驗室有效，他們將會繼續研究這項技術，調查重復率低的原因。這項新技術無疑為基因編輯技術的發明提供了新的研究方向和視角，其發展還處于初期階段，有關此方面的問題還需科學家們進一步研究和驗證。

其次，CRISPR改造生殖細胞受到了極大的倫理挑戰。中國廣州中山大學黃軍課題組［70］用CRISPR首次編輯了人類胚胎基因組，這一事件引起了廣泛的國際爭議，許多科學家強烈反對利用CRISPR改造人類生殖細胞。然而，2016年3月，英國人類生育與胚胎學管理局宣布正式批準了倫敦弗朗西斯·克里克研究所研究員Kathy Niakan對人類胚胎進行編輯的請求。

CRISPR/Cas9基因驅動技術和其改造人類生殖細胞一樣飽受爭議。如果基因驅動能夠在一定程度上控制一個物種的繁殖或生存，從理論上說，它就能夠讓該物種滅絕。加上CRISPR操作過程非常簡單易懂，那么，一旦有人濫用，對人類而言將是危害性的毀滅。因此，對CRISPR技術避害揚正，讓其更好地為人類服務，將是基因編輯界在研究過程中需要長期堅持的理念。

總之，CRISPR是新時代科學研究領域的有力工具，在食品、農業、醫學等方面具有十分廣闊的應用前景。但CRISPR不僅能進行基因組的編輯，而且在基因表達調控、細胞定位運輸功能、新型沉默RNA系統等方面的作用也不斷顯現。此外，人類誘導多功能干細胞（iPSCs）和CRISPR/Cas9技術的發展從根本上改變了研究者對生物醫學、干細胞生物學和人類遺傳學的研究［71］。如今CRISPR技術應用于功能基因組學研究、轉基因動物模型的構建、活細胞和組織中的基因組成像和譜系追蹤［72］。相信在不久的將來，CRISPR將能夠編輯整個生物網絡，幫助人類逐步理解細胞系統，不斷攻克各種疑難病癥。

致謝：感謝山西師范大學生命科學學院13540301班的全體同學（成曉輝，崔冰潔，丁晨，郭俊，王學葉，齊迎迎，何方建，胡亞楠，侯旭峰，金麟雨，劉卓群，盧貴享，聶志華，樸意娜，蘇鵬飛，王彤，趙丹，張玉萍，鄒玉麟）在文獻搜集、整理、翻譯中所做的貢獻。

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