牛的基因編輯技術研究進展

湯波 孫照霖 戴蘊平

（中國農業大學生物學院，北京 100193）

基因編輯技術是對基因組進行定點修飾的一種新興生物技術，由于可以對幾乎任何生物的基因組進行精確修飾，就像文字編輯軟件對論文進行字句的編輯一樣，因此被稱為基因編輯技術。目前基因編輯技術主要包括鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）技術、轉錄激活因子樣效應物核酸 酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術以及最新的成簇規律間隔短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技術。近年來，基因編輯技術就像“風暴”一樣席卷整個生命科學領域，在短短幾年時間內，這項技術已用于改造幾乎所有常見的微生物、植物和動物，甚至是人類細胞和胚胎，展現出令人驚喜的應用前景。由于牛的基因編輯難度大、制作成本高，牛的基因編輯技術發展稍晚于其他物種，但是基因編輯技術已開始在抗病、改善奶品質、提高瘦肉率、去取牛角等牛新品種培育領域發揮越來越重要的作用。

1 牛的基因編輯技術發展歷史

1987年，來自美國猶他大學的Mario Capecchi團隊及來自北卡羅來納大學的Oliver Smithies團隊分別建立了基于小鼠胚胎干細胞的基因打靶技術。2007年，上述兩人與胚胎干細胞的發明人、英國卡迪夫大學的Martin Evans教授一起分享了諾貝爾生理或醫學獎。

然而之后的十多年里，由于牛、豬、羊等大家畜的胚胎干細胞分離工作進展緩慢，基因打靶技術一直局限于小鼠身上。隨著1997年體細胞克隆綿羊“多莉”的誕生，大家畜基因打靶才陸續獲得突破。繼第一例基因打靶羊和基因打靶豬于2000年和2002年相繼問世之后，2004年美國Hematech公司首次利用“連續基因打靶技術”成功培育出了第一例多基因敲除牛［1-4］。

由于大動物體細胞的基因打靶效率極低，只有少數幾個實驗室利用Cre/loxP系統和體細胞克隆技術相結合，成功培育出了基因打靶牛［5-9］。盡管很多實驗室對基因打靶技術不斷進行條件優化和改進，但是哺乳動物細胞的基因打靶效率并沒有顯著提高，直到ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因編輯技術的出現，迎來了大家畜基因編輯時代的到來［10］。

1.1 鋅指核酸酶基因編輯技術

鋅指核酸酶，又叫鋅指蛋白核酸酶，是由鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）和Fok I內切核酸酶共同構成［11］。其中鋅指蛋白能夠識別和結合特異的DNA序列，Fok I核酸內切酶形成二聚體后能夠切割非特異性的DNA序列，對基因從而進行目的基因的修飾，此技術為第一代基因編輯技術。

ZFN 中的ZFP 結構域通常由3-6 個C2H2 類型的鋅指重復單位串聯而成，其基本骨架大多來自人或小鼠的天然鋅指蛋白ZIF268［12］。其中每個鋅指可直接特異識別DNA雙螺旋中某一條單鏈上3 個連續的核苷酸；由多個鋅指串聯形成的ZFP 結構域則可識別更長的靶序列，同時也就增加了DNA 靶向修飾的特異性［13］。當兩個鋅指核酸酶單體同各自的目標位點特異結合，且這兩個位點在 DNA 雙鏈上的距離和方向符合一定要求時，兩個 Fok I 切割結構域可形成二聚體的活性形式，在兩個結合位點的間隔區（Spacer，通常為 5-7 bp）中發生切割，產生DNA雙鏈斷裂（Double Strand Break，DSB）切口；緊接著細胞通過同源重組（Homologous recombination，HR）或非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）等方式修復 DSB，而這兩種修復方式中可能會出現人為的引入變化或是自發錯誤，從而造成基因組 DNA 序列的突變，實現基因打靶這一過程［14］。

2001年，Bibikova等［15］首次報道在非洲爪蟾卵母細胞內利用ZFN成功介導同源重組，引起國際生物領域的廣泛關注。很快，ZFN技術被廣泛應用于人類細胞和其它動物基因打靶研究。從2011年，中國農業大學的Yu等首次成功培育ZFN介導的基因打靶牛以來，已有多個多課題利用培育出ZFN技術培育出基因敲除牛和基因定點敲入牛［16-19］。

但是，ZFN技術也存在一些明顯的缺陷：一是存在脫靶效應，即ZFN除了在特異位點發揮作用，還非特異性地與目標位點以外的DNA序列相互作用，引發非特異位點的同源重組；二是ZFN技術并非適用于任何序列，由于鋅指蛋白的結構中只有α-螺旋的6個氨基酸可特異識別三連堿基，不是任意三連堿基組合都有對應ZFNs的模塊，所以ZFNs的靶點選擇受到限制；三是ZFN設計復雜，成本較高。這些缺陷都限制了ZFN技術的應用范圍。

1.2 TALEN基因編輯技術

轉錄激活因子樣效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）。TALEN 跟ZFN技術的作用原理一樣，結構也類似，主要由兩部分組成，包括識別并結合特異DNA序列的TALE蛋白結構域以及能夠切割非特異性DNA序列的Fok I核酸內切酶。

類轉錄激活因子效應物（TALE）主要由3個部分組成：C-端含有一個核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）和轉錄激活結構域（Activation domain，AD）、N-端一般含有轉運結構域（Translocation domain，TD）、而中間是能夠和DNA進行特異性結合的結構域。中間的DNA結合結構域是一段特別長的重復氨基酸序列、不同種類的TALE蛋白的中間結構域是由1.5-33.5個TALE單元組成的重復氨基酸序列組成、每個TALE單元由33-35個氨基酸殘基組成［20-21］。在一個重復的氨基酸序列中每個重復單元和末尾的半個重復單元均可特異性地識別并結合DNA的一個特定核苷酸位點，將TALEs與核酸酶結合即構建成完整的TALENs。

2010年，Christian和Li等兩個課題組［22-23］首先在酵母中證明了TALEN也能像ZFN一樣促進雙鏈斷裂，引發同源重組。之后不久，很多不同實驗室利用TALEN技術實現了不同物種的基因打靶。由于其特異性強、設計方便、成本低，TALEN逐步取代ZFN技術，成為新一代基因編輯技術，美國明尼蘇達大學、美國維克森林再生醫學研究所、中國西北農林科技大學的研究團隊相繼利用TALEN基因編輯技術對牛的體細胞、胚胎進行基因編輯，有些課題組最終還培育出了基因編輯牛［24-29］。TALEN可以和ZFN一樣對復雜的基因組進行精細的修飾，同時其構建相比ZFN較為簡單，特異性更高，因此受到了科研工作者的青睞。2012 年，TALEN 被《科學》（Science）雜志評為十大科學突破之一。

但是，TALENs的運用依然存在一些問題，例如：（1）TALENs載體大，具有有高度的重復序列，因此在設計和載體構建上都相對困難；（2）在目前的報道中，TALENs主要應用于單基因的敲除，而且一對TALENs敲出一個基因，因此多基因敲除很難實現；（3）TALE重復序列在什么長度下最適合用于DNA序列的識別，以及組裝成的TALENs是否具有最優的活性仍然不清楚；（4）TALENs脫靶的問題等。

1.3 CRISPR基因編輯技術

2012年，美國加州大學伯克利分校的Jinek等開發出一種全新的基因編輯技術，是第三代基因編輯技術。所不同的是，前兩種基因編輯技術的“查找”工具是酶類，設計和制作成本較高，而CRISPR/Cas9技術是用一種成簇的、規律間隔的短回文重復序列的RNA來尋找靶向序列。由于設計和制作RNA比蛋白質簡單，不僅構建成本得到大幅減降低，而且可以精確到單個堿基，同時脫靶效應也得到了極大的改善。

最早利用CRISPR/Cas9技術進行牛基因組編輯研究的是韓國忠北國立大學的研究人員。2014年，Heo等［30］將牛的成纖維細胞培養出誘導多能干細胞，然后將CRISPR/Cas9 mRNA注入牛誘導多能干細胞和胚胎，結果顯示CRISPR/Cas9系統能有效地進行牛的基因組編輯。而來自韓國另一所大學的Jeong等［31］利用CRISPR/Cas9系統將人成纖維細胞生長因子2基因定點敲入到牛β-酪蛋白基因座位上，以期高效表達重組生長因子。來自阿根廷的Bevacqua等［32］則利用CRISPR/Cas9系統成功敲除了牛體細胞和體外受精胚胎的朊蛋白基因，其中成纖維細胞的基因編輯效率接近50%，而受精卵的只有12.5%。西北農林科技大學的Gao等［33］建立了Cas9切口酶（Cas9n）定點整合外源片段的技術體系，獲得9個外源天然抗性相關巨噬細胞蛋白-1（NRAMP1）基因定點敲入的轉基因母牛，脫靶效應顯著減少，攻毒試驗顯示，轉基因牛對引發結核病的牛分枝桿菌的抗性明顯增強。2017年，日本國家農業生物技術研究所的Ikeda等［34］利用CRISPR/Cas9系統在體細胞水平和克隆胚胎水平，成功修復了日本黑牛中一種由單核苷酸替代引起的隱性遺傳病——異亮氨酸-tRNA合成酶（IARS）綜合征的致病基因。隨著各國科學家研究的深入，將會有很多的CRISPR/Cas9基因編輯牛誕生。

2 基因編輯技術在牛育種中的應用

基因編輯技術在動植物育種方面展現出巨大的應用前景，而目前在牛育種方面的應用則包括提高抗病性、改善奶品質、培育高瘦肉性、去取牛角等。

2.1 提高抗病力

瘋牛病、結核病、乳房炎等疫病的爆發和流行，不僅給養牛業帶來巨大的損失，也給養牛從業人員和消費者的健康帶來嚴重的危害。研究表明，通過基因編輯技術可以提高牛的抗病力，甚至可以根除一些疫病，如瘋牛病。

瘋牛病是牛朊蛋白結構變異引起成年牛的一種慢性、神經性、致死性人獸共患病。曾造成歐美國家19萬多頭牛死亡，疫區養牛業幾乎遭受毀滅性打擊。2007年，Richt等［6］通過連續打靶的方法成功獲得了健康存活20個月大的PRNP-/-克隆牛，這些牛在臨床解剖、生理發育、組織病理以及免疫和生殖發育方面都很正常，在這些牛的腦組織提取物中檢測不到PRNP基因的表達，在體外實驗中這些腦組織提取物能夠抑制瘋牛病致病因子的擴增。2013年，中國農業大學的Wang等［35］利用無啟動子打靶載體對牛PRNP基因進行了連續兩輪的基因打靶，并獲得了一頭健康存活的PRNP+/-克隆牛和3個PRNP-/-細胞克隆點。

基因編輯技術在防御其它疫病方面也發揮重要作用，特別是基因定點敲入一些抗病力相關基因。2013年，西北農林科技大學的Liu等［18］利用鋅指核酸酶和鋅指切口酶技術，將來自細菌的溶葡球菌酶基因定點插入到β酪蛋白基因位點，共獲得8頭健康存活的溶葡球菌酶基因定點敲入奶牛，其中兩頭轉基因奶牛催乳結果顯示，重組溶葡球菌酶在乳汁中含量為5 ng/mL，其活性相當于金黃色葡萄球菌來源的溶葡球菌酶的10%。之后，該實驗室繼續利用鋅指核酸酶技術，將來自細菌的溶葡球菌酶基因和人溶菌酶基因定點插入到β酪蛋白基因位點，共獲得5頭健康成活的人溶菌酶基因定點敲入奶牛。ELISA檢測結果顯示，重組人溶菌酶在轉基因奶牛乳腺中含量可達23-31 μg/mL，而牛奶中牛源溶菌酶含量僅為 0.05-0.22 μg/mL［19］。2015 年，同一個實驗室的Wu等［28］對TALEN中的FokI酶進行了D450A點突變改造，只保留Fok I酶單鏈酶切功能，利用改造后的TALEN將源自小鼠的SP110基因轉入牛的基因組，并培育出13頭健康存活6個月以上的轉基因奶牛，體內外的結核桿菌攻毒試驗顯示，該轉基因奶牛能有效抵抗結核桿菌的侵襲。

2.2 改善奶品質

牛奶含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物及多種維生素等營養成分，被譽為營養最為全面的食物之一。人乳中含有乳鐵蛋白、溶菌酶、α-乳清白蛋白、膽鹽激活脂酶和免疫球蛋白等功能活性蛋白，對于增強機體免疫力、抵御外來病原體、促進生長發育和智力發育等發揮著至關重要的作用，但是牛奶中這些功能蛋白含量極為微量，甚至沒有；而且牛奶中還含有一些人體難以吸收的蛋白質，如β-乳球蛋白（BLG）和α-酪蛋白等。增加乳蛋白含量，特別是一些功能蛋白，減少甚至是去除牛奶中的過敏成分，一直是奶牛育種的重要研究方向，但是讓牛奶中不含過敏成分，在不添加水解酶的情況下，目前只有基因編輯技術可做到。

2011年，中國農業大學的Yu等［16］首次利用ZFN技術成功培育出β-乳球蛋白基因敲除的奶牛，出生8頭克隆牛，其中有1頭健康存活，經檢測這些克隆牛均為β-乳球蛋白基因敲除奶牛，其中健康存活的克隆奶牛β-乳球蛋白兩個等位基因分別發生9 bp和15 bp的缺失，這也是國際上首例ZFN介導的基因打靶牛。鋅指核酸酶介導β-乳球蛋白基因敲除效率達20%以上，雙等位基因敲除效率也達6%以上，顯示ZFN基因編輯技術的效率遠高于傳統的基因打靶技術。該課題組還通過轉基因技術培育出高效表達乳鐵蛋白、α-乳清白蛋白、溶菌酶和膽鹽激活酯酶等功能蛋白的轉基因奶牛，并且成功純化出目的重組蛋白，這不僅大大提高了牛奶的品質，同時為利用轉基因牛乳腺生物反應器大規模制備功能性重組蛋白打下重要基礎［36-39］。由于傳統的轉基因技術都使用篩選標記基因，然而篩選標記基因往往引起生物安全問題。因此該課題組又建立了無篩選標記基因技術成功制備了不含有抗性篩選標記基因的高效表達重組人溶菌酶及重組人乳鐵蛋白的轉基因牛［40-41］。這些研究為利用乳腺生物反應器制備的重組功能性蛋白在未來的商業化打下重要基礎。同時這些利用常規轉基因技術及最新基因組編輯技術對牛奶品質的成功改良，也為最終實現“人源化牛奶”奠定重要基礎。

2.3 提高瘦肉率

高瘦肉率，高飼料轉化率是肉牛的重要育種目標，比利時藍牛和皮爾蒙特牛是兩種高瘦肉率的肉牛品種，控制肌肉生長的肌抑素基因發生突變是其品種形成的關鍵，國際上已有多個實驗室利用不同基因編輯技術培育出肌抑素基因打靶家畜，包括豬、牛和羊等［42］。

2014年，中國農業大學的Luo等［17］率先利用ZFN技術，對中國冀南黃牛細胞的肌抑素基因進行敲除，獲得了雙肌臀表型明顯的MSTN雙等位基因敲除冀南黃牛，其中一個等位基因缺失6 bp，另一個等位基因缺失117 bp，并有一個9 bp的插入突變，單等位基因敲除效率可達20%以上，而雙等位基因敲除的效率則達8.3%。之后研究人員將實現了肌抑素基因雙等位基因敲除的牛胎兒體細胞進行核移植操作，獲得了3頭健康存活的肌抑素基因雙等位基因敲除冀南黃牛公牛，這些基因敲除公牛1個月內就表現出“雙肌”表型，這也是國際上首次獲得的肌抑素基因敲除大家畜。美國明尼蘇達大學與英國羅斯林研究所合作，利用TALEN對綿羊和牛的肌肉生長抑制素基因進行了基因編輯，首次培育出TALEN介導的基因編輯牛，值得一提的是，該研究是利用卵子收集-體外受精-受精卵顯微注射的技術路線，而非體細胞克隆技術［26］。

2.4 去除牛角

給牛去角是養牛業的常規操作，以防止牛只打斗或傷及養殖人員。常用的去角方法包括刀具切割、烙鐵燒灼以及化學藥物去角等，這些方法不僅耗時，也會給牛只特別是幼牛造成不同程度的傷害或應激，被一些動物保護組織視為不人道的做法。不過，大約500-1 000年前，一些牛群中出現了無角的自然突變［43］，人們相繼培育出多個無角牛品種，如安格斯牛就是無角品種。基因檢測發現，無角基因位于牛第1號染色體上，有兩種等位基因，一種是在荷蘭Friesian奶牛中發現的復雜等位基因（PF），在1號染色體的1 909 352-1 989 480 bp處有一個80 128 bp的重復，另一種是在凱爾特牛中發現的簡單等位基因（Pc），在1號染色體的1 705 834-1 706 045 bp處有一個212 bp重復代替了第1 706 051-1 706 060 bp的一個10 bp缺失［29］。由于無角性狀屬于隱性遺傳，如果采用雜交等常規育種方法，需要20年以上才能讓奶牛群體擁有50%的無角性狀，而且無角性狀的選擇與奶產量等經濟性狀相沖突。

2013年，美國明尼蘇達大學Tan等［25，29］在細胞水平上，利用TALEN技術將Pc無角基因，替換荷斯坦奶牛基因組的等位基因，到2016年該實驗室在Nature Biotechnology上報道其成功培育出5頭健康存活的基因編輯荷斯坦無角奶牛，包括3頭純合子和2頭雜合子，其中兩頭純合子10個月大也沒有長角。目前該研究小組正在為這些基因編輯無角牛向美國農業部等部門提交申請，希望早日獲準上市。

3 關于加快基因編輯農業動物審批的建議

隨著基因編輯技術的日趨成熟，奶牛和肉牛育種中將會更多地應用到基因編輯技術。目前我國科學家已培育出無外源基因插入、目標性狀突出的β-乳球蛋白基因敲除奶牛和肌抑素基因敲除肉牛等新品系，急需建立一套有別于轉基因生物安全監管體系，適合基因編輯動物的安全監管體系，加快基因編輯動物的安全審批，以免我國在基因編輯技術產業化上喪失趕超國際領先水平的機會。

美國賓夕法尼亞州立大學的楊亦農（Yinong Yang）博士率先利用CRISPR/Cas9技術將一個容易引發蘑菇褐變的多酚氧化酶基因敲除，使得該酶的活性降低30%，大大延長了蘑菇保鮮時間。2015年10日底，楊亦農向美國農業部遞交了這種不含外源基因的基因編輯蘑菇免除監管的申請，2016年4月美國農業部給楊亦農回信稱，決定放開對不含外源基因的基因編輯蘑菇監管［44］。2018年3月28日，美國農業部部長再次宣布不對基因編輯作物進行監管［45］。歐盟也傾向于對基因編輯生物的監管不像轉基因生物那樣嚴格［46］。

鑒于美國、歐盟等國際已經出臺或正在制定針對基因編輯生物的監管政策，因此建議我國盡快出臺相關指導性意見，將基因編輯動物分成兩大類，第一類雖然也采用基因編輯技術，但是引入了外源基因，這類基因修飾動物則需要按照轉基因生物安全評價和監管體系進行評價和監管；第二類是只對目的基因進行修正或破壞，以及引入與自然突變相同的突變，這類基因編輯動物不含有外源基因，則只需要研發者提供對目標基因編輯、無外源基因導入、無脫靶效應等檢測報告，即可準許其進行商業化開發，著重減少審批環節、縮短審批流程，加快審批進度，這樣將極大地加速我國基因編輯牛及其它動物產業化進程。

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［43］Medugorac I, Seichter D, Graf A, et al. Bovine polledness--an autosomal dominant trait with allelic heterogeneity［J］. PLoS One, 2012；7（6）：e39477.

［44］Letter for “Request for confirmation that transgene-free, CRISPR-edited mushroom is not a Regulated article”. https://www. aphis.usda. gov/biotechnology/downloads/reg_loi/15-321-01_air_response_signed. pdf.

［45］Secretary Perdue Issues USDA Statement on Plant Breeding Innovation. https://www. usda. gov/media/press-releases/2018/03/28/secretary-perdue-issues-usda-statement-plant-breeding-innovation.

［46］European Court Supports the Softening of CRISPR Gene Editing Rules. https://labiotech. eu/crispr-gene-editing-court/.