海洋放線菌BH3A8代謝產物殺線蟲活性研究

田陽　何宗均　孫建華

摘 要：植物寄生線蟲的危害日趨嚴重，利用生物防治技術是控制線蟲危害的研究重點。對從渤海海域不同深度水樣中篩選出的具有殺線活性的菌株BH3A8代謝產物進行研究，測定了BH3A8代謝產物殺線蟲譜和對南方根結線蟲的溫室防效以及對松材線蟲形態與運動頻率的影響。結果表明，BH3A8代謝產物對南方根結線蟲幼蟲毒力最強，對松材線蟲幼蟲毒力次之，對大豆孢囊線蟲幼蟲毒力最弱。在溫室測定中活性菌株發酵液對南方根結線蟲防治效果為73.75%。活性菌株代謝產物明顯抑制松材線蟲運動頻率。中毒線蟲起初表現為蟲體扭曲、顫抖、痙攣，接著線蟲游動緩慢、扭動身軀，最后線蟲反應遲鈍，擺動減慢，首尾同側展開，標志著線蟲死亡。蟲體死亡多為僵直狀態。BH3A8殺線蟲譜廣、效果好、使用成本低，在生產上具有很好的應用前景。

關鍵詞：海洋放線菌；活性菌株；殺線蟲活性代謝物；毒力；防效

中圖分類號：S476 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.003

線蟲在自然界分布廣泛，種類繁多，危害多種動物和植物。植物寄生線蟲是植物侵染性病癥主要病原之一，廣泛寄生在各種植物的根、莖、葉、花、芽和種子上，一種植物可以有一種或者多種寄生線蟲，使植物發生各種病變，嚴重阻礙了農林業的發展[1]。植物寄生線蟲的種類已達100多屬2 000多種[2-3]，農林業生產上的主要線蟲約1 100種[4]。植物寄生線蟲對農業生產的危害很大，其中危害主要農作物的寄生線蟲約500多種，其危害程度超過了細菌和病毒，僅次于真菌病害[5-7]。嚴重危害我國農業、林業、經濟作物的植物寄生線蟲已達100多種，有些植物寄生線蟲對作物的直接危害甚至比其他病、蟲、草害都嚴重，一般只要作物上發生植物寄生線蟲引起的病變，就可以使該作物減產10%～40%，在嚴重的情況下，可以減產70%～80%，最為嚴重的就是造成絕收[8-9]。

植物寄生線蟲的非生物防治方法主要包括農業技術設施防治、抗性育種、物理防治和化學防治等4類。植物寄生線蟲目前還是主要采取化學殺線蟲劑進行線蟲防治[10]，化學防治雖然效果好，但是其中大部分藥劑對人畜有劇毒、用量高、花費大、嚴重污染環境和地下水源，破壞生態平衡，而且農藥的殘留污染直接影響農產品深加工的質量和品質，與此同時，化學農藥在殺滅植物病原線蟲的同時，也殺傷了天敵及其他有益生物，影響了生物多樣性，破壞了生態平衡，化學殺線劑的應用正逐步受到限制[11-13]。所以生物防治成為研究熱點。

在線蟲的生物防治中，抗生素的應用是較為有效的防治途徑之一。海洋占地表面積的71%，海洋中生態環境較陸地復雜多變，所以海洋放線菌會通過一些特殊的代謝途徑來維持其生命活動。近十幾年來，已經從海洋微生物及其代謝產物中發現了許多結構新穎、活性獨特的活性物質，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲等活性。目前有很多利用海洋真菌代謝產物殺線的報道，但是殺線種類較單一[14]。海洋放線菌主要分布在海底沉積物、海洋生物表面以及海水中，天津地處渤海灣，擁有豐富的海洋資源，因此，從中篩選到有殺線活性的菌株是有很大幾率的[15-17]。

海洋放線菌BH3A8是本課題組從渤海不同深度海水樣品中篩選出的具有殺線活性的生防菌株。本試驗著重對其殺線蟲譜、溫室防效以及對松材線蟲形態與運動頻率的影響的初步機理進行研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試菌株海洋放線菌BH3A8菌株是天津市農業資源與環境研究所微生物研究室篩選保藏的菌種。

1.2 試驗方法

1.2.1 活性菌株BH3A8發酵液的制備 第1步，海洋放線菌菌株BH3A8的種子培養。挑取純化菌株至種子培養液中，28 ℃，200 r·min-1，震蕩培養3 d。第2步，海洋放線菌菌株BH3A8的發酵培養。配制發酵培養基，將種子液按1∶10比例轉接至發酵培養液中，28 ℃，200 r·min-1，震蕩培養7 d。將發酵液用甲醇萃取后旋轉蒸發濃縮成8倍液后，放入-10 ℃冰箱保存。

1.2.2 供試線蟲的制備 （1）松材線蟲二齡幼蟲（J2）的制備。參照文獻[18]中松材線蟲J2制備方法。在無菌操作條件下，將灰葡萄孢霉（Batrytiscinerea）接種于察氏培養基上，21 ℃下避光培養7 d，待菌絲長滿培養皿后，將松材線蟲接種于該菌絲上進行培養繁殖，26 ℃下避光培養5～7 d。通過貝爾曼（Baermann）漏斗法收集松材線蟲，無菌水離心洗滌3次，2 000 r·min-1離心3次，每次3 min。用無菌水將離心得到的松材線蟲稀釋為1 000頭·mL-1的懸液備用。

（2）南方根結線蟲二齡幼蟲（J2）的制備。參照文獻[18]中根結線蟲J2制備方法。取溫室里接種南方根結線蟲60 d后的番茄的根，將根剪成1～2 cm的小段；把根放于200 mL 1%的次氯酸鈉溶液中，在豆漿機中攪拌剪切1～4 min；將懸浮液快速經孔直徑0.15 mm，0.05 mm和0.03 mm的網篩，上下震蕩網篩，在0.03 mm的網篩上即可收集到游離的卵；隨即快速用無菌水沖洗0.03 mm的篩網上的的卵，以除去殘留的次氯酸鈉；再次沖洗震蕩根段以獲取更多的卵，用過篩法收集到離心管中，在底部加入40%蔗糖溶液20 mL梯度離心，3 500 r·min-1，5 min，吸取界面溶液過0.03 mm篩，用水沖洗篩子去除蔗糖，反向將卵沖入三角瓶中。將卵置于自制孵化器中，加無菌水放置在25～28 ℃環境條件下孵化；4 d左右會孵出大量的J2，收集到滅菌三角瓶中，置于4 ℃冰箱中備用[19]。

（3）大豆孢囊線蟲二齡幼蟲（J2）的制備。參照文獻[18]中孢囊線蟲J2制備方法。將大豆種植在溫室的病原土壤中，孢囊成熟后挖出根系和根系周圍土壤，用過篩法分離孢囊，選取新鮮飽滿成熟的褐色孢囊放在自制孵化池中用0.5%次氯酸鈉溶液消毒3 min，再用無菌水沖洗3遍，加入自制孵化池中，在25 ℃，4 mmol·L-1ZnCl2溶液中孵化。4 d左右會孵化出大量的J2，收集至滅菌的三角瓶中，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.3 活性菌株BH3A8發酵液殺線蟲譜的測定 采用梯度稀釋法，在滅菌的96孔細胞培養皿中加入50 μL不同處理濃度的BH3A8菌株發酵液，以無菌水為陰性對照，以5×10-6的阿維菌素和苯線磷為陽性對照，分別向處理和對照中加入50 μL濃度為1 000 條·mL-1南方根結線蟲、松材線蟲和大豆孢囊線蟲3種不同線蟲，4次重復，放入25 ℃生化培養箱中，24 h后觀察線蟲形態，僵直或卷曲不動的蟲體視為死亡，記錄線蟲死亡率，計算校正死亡率，線蟲死活判斷采用NaOH刺激法[20]。

死亡率=（死亡線蟲數/總線蟲數）× 100%

校正死亡率= [處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率/1-對照組線蟲死亡率] ×100%

1.2.4 活性菌株BH3A8發酵液對南方根結線蟲的溫室防治效果 在平均溫度26 ℃左右、濕度68%左右的溫室大棚中，將黏土和沙子按1∶3混合，干熱滅菌后，放入15 cm×15 cm的塑料缽內，每缽1 kg，之后移入三葉期番茄幼苗，每盆使用4倍放線菌BH3A8菌株發酵液50 mL進行灌根處理，以清水作為陰性對照，5×10-6的苯線磷作為陽性對照，培養5 d后，在植物根周圍均勻地插3個小孔，將配置好的南方根結線蟲卵懸浮液滴入小孔中，每盆接種1 000個蟲卵。培養45 d后，根據根部癥狀評定病情指數，計算防治效果，并測量番茄植株的根長和根重。試驗采用隨機區組設計，每個處理20個重復。

病情指數分級標準為：0級，健康無病（根系上無根結）；1級，1%～20%根系上有根結，但根結相互不連接；2級，21%～40%的根系上有根結，僅少量根結相互連接；3級，41%～60%的根系上有根結，半數以下根結相互連接；4級， 61%～80%的根系上有根結，半數以上根結相互連接，部分主、側根變粗呈畸形；5級，80%以上的根系上有根結，且相互連接，多數主、側根呈畸形。

病情指數=[Σ（各級病根數×級數）/調查株數×5] ×100%

防治效果=（對照病情指數-處理病情指數/對照病情指數）×100%

1.2.5 活性菌株BH3A8代謝產物對松材線蟲運動頻率及形態變化的影響 （1）松材線蟲處理方法。線蟲的收集方法同上介紹的，用無菌水將離心得到的線蟲稀釋為約15 000 頭·mL-1的懸液，每200 μL分裝于滅菌的玻璃瓶中，同時分別加入兩株菌的代謝產物原液2 mL[21-23]，迅速混勻，計時測量，加滅菌水作對照，置于26 ℃培養箱中；（2）觀測方法。在供試線蟲分別處理0，2，4，8，16，24 h后，取平行對照和處理同時觀察。具體方法為取含10條左右線蟲的混合液點于表面皿上，室溫26 ℃解剖鏡下觀察線蟲的形態變化和擺動頻率，同時用顯微成像儀進行記錄；每個處理均觀測3次，擺動頻率取3次觀測值的平均值[24]。

2 結果與分析

2.1 活性菌株BH3A8發酵液對3種線蟲幼蟲活性的影響

BH3A8菌株發酵液對南方根結線蟲、松材線蟲和大豆孢囊線蟲幼蟲均有較好的抑制作用，對南方根結線蟲抑制效果最好、松材線蟲次之，對大豆孢囊線蟲效果最差。稀釋4倍的活性菌株發酵液對大豆孢囊線蟲、南方根結線蟲、松材線蟲的致死率均為100%；稀釋16倍后，對南方根結線蟲、松材線蟲的致死率仍為100%，但對大豆孢囊線蟲致死率顯著下降，僅為13.11%。活性菌株發酵液對南方根結線蟲的抑制作用明顯高于松材線蟲，稀釋24倍后，對南方根結線蟲的致死率為100%，但對松材線蟲的致死率為46.31%。

2.2 活性菌株BH3A8發酵液對南方根結線蟲溫室防效

在溫室，對盆栽番茄用BH3A8發酵液的4倍稀釋液進行灌根處理，培養45 d后對各指標進行調查，結果見表2。

活性菌株的溫室試驗結果表明，菌株BH3A8發酵液對南方根結線蟲的防效達73.75%，陽性藥物苯線磷對南方根結線蟲防效為81.25%，活性菌株發酵液對南方根結線蟲的防效與陽性藥物防效相當。此活性菌株代謝產物不僅在實驗室測定中表現出了很高的殺線活性，在溫室測定中同樣表現出了較高的防效，具有開發成為線蟲生防制劑的潛能。

2.3 活性菌株BH3A8代謝產物對松材線蟲運動頻率及形態變化的影響

由結果可知，在2 h處理時間內，處理組和對照組在刺激前后運動頻率有微小變化，但并不是很明顯；處理時間達到4 h后，對照組和處理組相比有較明顯的變化，分別為1.18 次·s-1和0.88 次·s-1；8 h時，對照組與處理組的平均頻率有了明顯變化，分別為1.02 次·s-1和0.62 次·s-1，線蟲反應緩慢；16 h時，對照組與處理組平均頻率有了明顯變化，分別為0.99 次·s-1、0.36 次·s-1，處理組線蟲僅有少部分偶爾極其緩慢地伸展開，處理前后，16 h處理組的反應靈敏度和運動頻率同4 h處理組運動頻率相比，幾乎呈等比下降，說明線蟲的反應靈敏度及運動能力均隨著處理時間的增加幾乎呈線性下降趨勢；至24 h，對照組平均頻率為0.97 次·s-1，處理組的平均運動頻率為0 次·s-1，線蟲全部僵直死亡。根據線蟲的運動頻率，可以看出，處理組的線蟲運動頻率遠遠低于對照組的運動頻率，即BH3A8的16倍稀釋發酵濾液減緩線蟲運動頻率的效果很明顯。

2.3.2 BH3A8活性代謝產物對松材線蟲形態的影響 在試驗過程中，觀察到中毒線蟲起初表現為蟲體扭曲、顫抖、痙攣，接著線蟲游動緩慢、扭動身軀，最后線蟲反應遲鈍，偶爾扭動身軀，直至線蟲死亡、蟲體僵直（圖2）。

正常的線蟲形態為圖2（a）所示的“S”型，隨著時間的延長，發酵液處理后線蟲形態發生變化。處理組線蟲在短時間內（<8 h）由正常的“S”型大量轉變為應激性的扭曲和纏繞狀態，有“Ω”型和“ξ”型如圖2（b，c），隨著時間的延長，中毒加深，蟲體由應急狀態轉變為延伸狀態，有“7”型和“C”型如圖2（d，e），這一過程，以頭尾同向為顯著特征，是線蟲瀕死的形態和行為標記，最終成C形和直挺狀，線蟲死亡如圖2（f）。其瀕死過程的行為特征表現為應激性的扭動頻率加快、滾動紐結，進而痙攣性抖動，隨后線蟲的動頻減緩、擺幅減小、應激反應遲鈍，蟲體呈頭尾同側展開，標志著線蟲即將死亡。死亡蟲體多呈僵直狀態。發酵濾液處理的線蟲與對照相比，線蟲的運動有明顯的減慢趨勢，明顯影響線蟲的活力。形態學的變化也證明了該菌株的發酵濾液確實有殺線蟲的活性，而對于線蟲的中毒機理有待于今后繼續研究。

3 結論與討論

放線菌菌株發酵液活性成分復雜，不同成分對不同線蟲的活性位點作用也不盡相同，所以同一菌株的發酵液對不同種類線蟲的生物活性存在很大的差異。菌株發酵液對于3種不同線蟲J2均有一定抑制作用。溫室防效試驗中該菌株發酵液防效與陽性對照相當，具有開發成環境友好生物農藥的潛能，北方蔬菜大棚種植面積大，蔬菜根結線蟲侵染嚴重，若將其應用于生產將對蔬菜根結線蟲防治產生重大影響。菌株發酵液對松材線蟲活動有明顯抑制作用，其作用機理有可能是抑制神經傳遞。BH3A8是一株具有廣泛應用前景的生物防治菌株，對該菌代謝產物中活性物質的分離純化和致死機理還需進一步研究。

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3 結論與討論

放線菌菌株發酵液活性成分復雜，不同成分對不同線蟲的活性位點作用也不盡相同，所以同一菌株的發酵液對不同種類線蟲的生物活性存在很大的差異。菌株發酵液對于3種不同線蟲J2均有一定抑制作用。溫室防效試驗中該菌株發酵液防效與陽性對照相當，具有開發成環境友好生物農藥的潛能，北方蔬菜大棚種植面積大，蔬菜根結線蟲侵染嚴重，若將其應用于生產將對蔬菜根結線蟲防治產生重大影響。菌株發酵液對松材線蟲活動有明顯抑制作用，其作用機理有可能是抑制神經傳遞。BH3A8是一株具有廣泛應用前景的生物防治菌株，對該菌代謝產物中活性物質的分離純化和致死機理還需進一步研究。

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放線菌菌株發酵液活性成分復雜，不同成分對不同線蟲的活性位點作用也不盡相同，所以同一菌株的發酵液對不同種類線蟲的生物活性存在很大的差異。菌株發酵液對于3種不同線蟲J2均有一定抑制作用。溫室防效試驗中該菌株發酵液防效與陽性對照相當，具有開發成環境友好生物農藥的潛能，北方蔬菜大棚種植面積大，蔬菜根結線蟲侵染嚴重，若將其應用于生產將對蔬菜根結線蟲防治產生重大影響。菌株發酵液對松材線蟲活動有明顯抑制作用，其作用機理有可能是抑制神經傳遞。BH3A8是一株具有廣泛應用前景的生物防治菌株，對該菌代謝產物中活性物質的分離純化和致死機理還需進一步研究。

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