基于近紅外與中紅外光譜技術的淀粉回生度檢測

鄒小波　崔雪平　石吉勇　胡雪桃　徐藝偉　薛　瑾

(江蘇大學食品與生物工程學院， 鎮江 212013)

0　引言

淀粉回生是指淀粉糊在室溫或低溫下儲存一段時間后，分子狀態從無序到有序的過程[1]。回生會改變淀粉的優良特性，影響淀粉食品的外觀和口感，且對淀粉酶具有抗性，食用后易引發消化系統疾病；然而在某些食品加工過程中，又需要添加適當的回生淀粉，以增強食用口感和某些生理功能[2-3]。所以需清楚淀粉在加工儲存過程中回生度變化情況，為淀粉食品加工過程提供指導。

檢測淀粉回生度的方法有很多，比如淀粉酶法[4-5]、X-射線衍射法(XRD)[6]、脈沖核磁共振法(PNRM)[7]、光譜技術等。光譜技術能夠檢測待測物質中基團結構的變化情況[8]，從而對食品成分或品質進行定量、定性分析[9-10]。中紅外光譜主要呈現基團分子基頻的伸縮或彎曲振動信息，近紅外光譜主要呈現分子基團倍頻、合頻振動信息，具有方便快捷、成本低、可在線檢測等優勢[11]，在食品工業中應用非常廣泛。一些研究者已經將紅外光譜技術用于檢測淀粉特性，如拉曼光譜檢測淀粉中直鏈淀粉的含量[12]，中紅外光譜技術表征淀粉回生過程中淀粉結構的變化情況[13]，還有運用傅里葉紅外光譜中一些特征振動峰的相對強度與差示掃描量熱法測定的回生焓值相關性來預測淀粉回生度[14]。

玉米淀粉在回生過程中分子內氫鍵數量及分子結構會發生改變，因此可利用近紅外和中紅外光譜技術檢測淀粉結構變化情況，以分光光度法檢測的回生度為化學參考值，建立快速檢測淀粉回生度模型。本文分別運用近紅外、中紅外以及兩者融合的光譜數據，結合偏最小二乘法(PLS、iPLS、siPLS和biPLS)建模，尋找最佳的檢測方法，以達到快速、無損檢測淀粉回生度的目的。

1　材料與方法

實驗所用玉米淀粉購自鎮江市潤州淀粉公司。

1.1　回生淀粉的制備

取1 g玉米淀粉懸浮于19 mL水中，加熱至100℃，均勻攪拌1 h，使其完全糊化。淀粉糊在4℃下儲存不同時間(0、1、2、3、4、5、10、15、20 d)，對不同儲存時間的回生淀粉進行冷凍干燥，粉碎，然后按照四分法原則，隨機抽取樣本，每個儲存時間取10個平行樣本，9個儲存時間共90個樣本，裝入自封袋，貼好標簽，然后保存在干燥器中，備用。

1.2　淀粉回生度的測定

本研究采用α-淀粉酶法[4-5]測定淀粉的回生度，具體步驟為：準確稱取25 mg的樣品，加入去離子水8 mL，并震蕩混勻，然后加入3.5 u/mL α-淀粉酶溶液2 mL和0.1 mol/L醋酸鹽緩沖溶液(pH值5.6)2 mL。于37℃條件下培養10 min后，加入4 mol/L NaOH溶液5 mL停止酶反應，再用4 mol/L的HCl調整溶液pH值至中性，最后定容到100 mL。取出10 mL的水解液，加入0.2%I2-2%KI溶液5 mL，再次定容至100 mL，靜置20 min之后，用紫外可見分光光度計在625 nm處測定其吸光度。回生度的計算公式為

(1)

式中D——淀粉回生度，%

a——總淀粉吸光度

b——實驗用淀粉吸光度

c——完全糊化淀粉吸光度

1.3　紅外光譜的采集和預處理

(1)紅外光譜數據采集

通過近紅外光譜儀(美國賽默飛世爾公司)掃描回生淀粉，以儀器內置背景為參比，積分球漫反射，掃描波數為4 000～10 000 cm-1，掃描次數為16次，分辨率為8 cm-1，波數間隔為3.853 6 cm-1，每條光譜包含有1 557個變量。通過中紅外光譜儀(美國熱電公司)掃描回生淀粉，采集區間650～4 000 cm-1，掃描次數為64次,分辨率為2 cm-1，每條光譜包含有6 550個變量。數據采集過程中，室內濕度基本保持不變，溫度保持在23℃左右。采集光譜時，每個樣品采集3個點，并取平均值得到1條原始光譜。

(2)紅外光譜數據預處理

經掃描獲得的NIR(近紅外)/MIR(中紅外)光譜數據需預處理，由檢測器檢測到的光譜信號不僅包含樣品待測成分信息，還有各種儀器雜噪聲(高頻隨機噪聲、基線漂移、樣品背景等)，這直接影響所建立模型的可靠性和穩定性，因此處理數據前，首先需要針對特定的光譜測量和樣品體系，對測量的光譜數據進行合理的處理，減弱甚至消除各種非目標因素對光譜信息的影響[15]。常用的預處理有數據標準化處理、數據平滑、去噪處理等方法。

1.4　數據處理方法

對采集得到的90個樣品平均光譜數據應用Matlab軟件進行分析，為減少或消除非目標因素對光譜數據的影響，常采用平滑和一階導數預處理方法，提高信噪比、分辨率和靈敏度。經處理后的光譜圖如圖1所示，R表示反射率。然后把90個樣本劃分為校正集(63個)和預測集(27個)，并將光譜數據(近紅外、中紅外以及兩者融合技術)與回生度化學值相關聯，運用偏最小二乘法(PLS、iPLS、biPLS、siPLS)建立定量模型，然后根據交互驗證均方根誤差以及相關系數來選擇最佳檢測模型，最后得到淀粉回生度的最佳檢測模型。

圖1　不同儲存時間的玉米回生淀粉中紅外和近紅外光譜圖Fig.1　Mid-infrared spectra and near infrared spectra of corn starch with different storage times

2　結果與分析

2.1　光譜分析

玉米淀粉回生的紅外光譜曲線如圖1所示，隨回生度的增加光譜曲線走向沒有很大差別，即光譜圖的變化趨勢基本相同，吸收峰的位置相同，但由于其基團含量不同，吸收強度稍有不同。如圖1所示，650～1 300 cm-1波段是化合物的特征指紋區，當分子結構略有變化時即可在吸收峰上表現出細微差異，該區間含有淀粉基本結構α-D-吡喃葡萄糖環和淀粉結構(晶體區和無定形區)特征振動，1 047 cm-1處淀粉結晶區域的特征振動，1 022 cm-1處非結晶區域淀粉的特征振動[16]，920～960 cm-1區間內α-1,4-糖苷鍵(C—O—C)的振動， 764、860、1 094 cm-1附近的C—C鍵伸縮振動、CH2鍵變形振動、COH的彎曲振動等[17]，該區域內振動信息復雜多樣；C—H鍵的彎曲振動和伸縮振動分別位于1 450 cm-1和3 000 cm-1附近，合頻和一次倍頻在4 347 cm-1和5 700 cm-1附近，O—H基團的彎曲振動和伸縮振動位于1 350 cm-1附近和3 600 cm-1附近，其合頻位于5 000 cm-1附近。這些基團的振動信息可以與淀粉回生度相關聯來建立模型。

2.2　回生度分析

90個淀粉樣本的回生度統計結果如表1所示，隨著儲存時間的增加，淀粉的回生度逐步增長，但增長速率明顯下降。這是由于雖然直線型的直鏈淀粉和高度分支的支鏈淀粉都參與了淀粉的回生過程，然而，前者主要參與回生的最初階段，即由直鏈淀粉的膠凝有序和結晶所引起，此過程較為迅速，可以在糊化后較短的時間內完成；而支鏈淀粉由于其分子結構自身的剛性在回生過程中所需時間較長，此為長期回生，即是由支鏈淀粉外側短鏈的重結晶引起的，該過程是可逆的[18]。0～1 d及1～2 d的回生度增長最快，均在20%以上，主要是淀粉的短期回生，其后增長速率較慢，主要是淀粉的長期回生。這與余世鋒等[19]所描述的玉米淀粉凝膠在4℃儲藏時7 d回生過程基本結束相符。每個儲存時間的樣品隨機選擇7個作為校正集，3個樣本作為預測集，校正集共63個樣本，預測集共27個樣本。

表1　不同儲存時間淀粉的回生度Tab.1　Retrogradation degree of starch at different storage times

2.3　近紅外和中紅外光譜模型

本研究分別采用近紅外和中紅外光譜數據與淀粉回生度化學值進行 PLS、iPLS、biPLS、siPLS建模，以校正集的交互驗證均方根誤差值為區間選擇依據，以實測值與預測值的相關系數為模型選擇依據，對模型進行優選以獲得最佳模型。

如表2、3所示，就近紅外光譜建模而言，模型較佳的是全光譜PLS模型以及siPLS模型，其校正集相關系數和交互驗證均方根誤差，以及預測集相關系數和預測均方根誤差分別是0.903 7和11.5%，0.862和13.2%，0.897 8和11.8%，0.858 8和16.2%。且模型的入選區間均包括第3區間，即4 804.12～5 201.39 cm-1波段，該區間含有O—H的合頻信息，與淀粉回生的特性相關。就最佳模型來說，綜合考慮選擇siPLS模型,就相關系數來說PLS的預測能力最好，但其含有1 557個變量，變動性較大，而siPLS模型與PLS的相關系數僅相差0.003 2～0.005 9，但只包含415個變量，極大的提高了模型的魯棒性。

對于中紅外光譜來說，模型較佳的是biPLS和siPLS模型，其模型的校正集相關系數和交互驗證均方根誤差，以及預測集相關系數和預測均方根誤差分別是0.932和9.65%，0.881和12.9%，0.930 4和9.96%，0.881 6和12.8%。且3種模型的入選區間均包含第4區間(1 322.7～1 770.29 cm-1)，該區間含有O—H的彎曲振動信息，同樣與淀粉回生的特性相關。就最佳模型來說，綜合考慮選擇siPLS模型，較biPLS模型，siPLS使變量數從3 939降低至1 885，而相關系數僅降低0.001 6,極大地簡化了模型，提高了穩定性。

總體來說，較近紅外光譜來說，中紅外光譜所建立的模型更佳。原因是中紅外到近紅外，光譜的靈敏度及其信息量隨著倍頻的增加以數量級的速度衰減，到高級倍頻時丟失了大量有用信息[20]，中紅外可以呈現更多的信息。

表2　PLS、iPLS、biPLS、siPLS譜區模型篩選統計Tab.2　PLS, iPLS, biPLS and siPLS spectral model screening statistics

2.4　近紅外和中紅外融合光譜模型

近紅外和中紅外光譜技術均可較為快速、無損地預測淀粉回生度，但它們的預測機制不同，為獲取更好的預測模型，可將近紅外和中紅外光譜融合建模，即同時將特征分子基團(羥基)的基頻以及倍頻、合頻振動信息與回生度化學值相關聯，結合化學計量學方法建立模型。具體來說是選擇將近紅外光譜的優選區間(1、3、12、15)以及中紅外的優選區間(1、4、10、11)進行融合，得到2 270個光譜變量，將融合后的光譜數據與淀粉的回生度進行PLS、iPLS、biPLS、siPLS建模，其結果如表2所示，biPLS模型預測能力最好，其在選擇9個子區間(1、2、3、4、5、7、9、12、13)聯合時交互驗證均方根誤差最小，為6.79%。此時校正集和預測集的相關系數r分別為0.965 5和0.931 3，如表3所示。最佳預測模型的玉米淀粉回生度預測值與實測值的散點圖如圖2所示。

表3　各個模型相關系數比較Tab.3　Comparison of correlation coefficient of each model

圖2　biPLS 最佳模型的樣本預測值與實測值關系Fig.2　Relationships between predicted and actual values from biPLS models

2.5　模型可靠性檢驗

重新取該批次玉米淀粉樣本27份，來校驗淀粉回生度預測模型的可靠性。同1.2節方法處理，每一個儲存時間有3個平行樣本。樣本經近紅外、中紅外光譜儀掃描后用2.4節的模型進行預測，樣本的預測結果見圖3。同時將樣品的回生度與預測值進行配對t-檢驗，在95%的置信區間內，其雙側sig.值為0.627，即p>0.05，兩者差異不顯著。由此證明該模型可靠。

圖3　不同儲存時間淀粉回生度的預測結果Fig.3　Predictive result of retrogradation degree at different storage times

3　結束語

利用近紅外、中紅外以及兩者融合技術實現了淀粉中回生度的快速檢測。將儲存不同時間的回生淀粉樣品進行近紅外和中紅外光譜掃描，分別將近紅外、中紅外以及兩者融合的光譜數據與化學值結合建立PLS模型。結果顯示，近紅外和中紅外融合光譜技術biPLS預測模型效果最佳，對應的交互驗證均方根誤差和預測均方根誤差分別為6.79%和9.52%，校正集和預測集相關系數分別為0.965 5和0.931 3，且測試集t-檢驗顯示預測結果與實際值差異不顯著。研究結果表明，近紅外和中紅外融合光譜技術優于近紅外和中紅外單一的光譜技術，能更準確地預測淀粉回生度信息，因此，近紅外和中紅外光譜法可快速、高效、無損檢測玉米淀粉的回生度。

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