富含γ-氨基丁酸豆芽乳發(fā)酵工藝優(yōu)化

張金蘭　代田田　王丹婷　李平蘭

(1.中國農(nóng)業(yè)大學北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院， 北京 100083)

0　引言

氨基丁酸(GABA)是一種非蛋白質(zhì)、水溶性的氨基酸，主要是由谷氨酸脫羧酶(GAD，EC 4.1.1.15)催化L-谷氨酸脫羧而產(chǎn)生，通過線粒體GABA轉氨酶(GABA-T，EC 2.6.1.19)轉化為琥珀酸半醛來代謝。GABA是主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可以通過降低血壓、預防慢性酒精性疾病、抑制癌細胞增殖、改善腦功能、促進胰島素釋放為人類和其他動物的健康提供有益的影響[1-2]。盡管GABA廣泛存在于植物、動物和微生物中，但其含量很低，這激發(fā)了研究者開發(fā)富含γ-氨基丁酸食品的興趣。

乳酸菌在最近幾年被應用于GABA生產(chǎn)。例如，短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等應用于富含GABA的食品和藥品合成[3-5]。產(chǎn)GABA的乳酸菌大多在合成或半合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵后GABA的純化是必不可少的，這將增加生產(chǎn)的時間和成本。應用天然的培養(yǎng)基(如乳制品、谷物、水果、蔬菜等)來培養(yǎng)乳酸菌，獲得富含GABA的食品可以避免上述問題，由此成為有價值的研究方向。

豆芽富含膳食纖維、多種營養(yǎng)成分和生物活性成分[6]。大豆發(fā)芽并經(jīng)適當處理后，不僅增加了人體必需的氨基酸和維生素，提高了大豆的營養(yǎng)價值，也減少了豆腥味。在大豆發(fā)芽過程中，隨著蛋白質(zhì)的降解，產(chǎn)生了多種的游離氨基酸，這為GABA的合成提供了天然的底物。

研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生GABA的能力，受培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)條件和其他因素的影響[7]。優(yōu)化培養(yǎng)基對于提高發(fā)酵過程中GABA的產(chǎn)量非常重要。響應面法(Response surface optimization, RSM)是一個組合統(tǒng)計學和數(shù)學用于優(yōu)化生物過程的技術。它可以用來評估幾個影響因素的影響，通過同時改變幾個因素，進行有限數(shù)量試驗來實現(xiàn)擬合建模。依據(jù)對影響GABA生產(chǎn)的關鍵因素，選擇一個獨立的變量，RSM用于優(yōu)化培養(yǎng)因素以提升GABA的產(chǎn)量。本研究在單因素試驗的基礎上，利用中心組合試驗設計(CCD)和響應面分析法建立高產(chǎn)γ-氨基丁酸植物乳桿菌發(fā)酵的數(shù)學模型，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，提高植物乳桿菌發(fā)酵豆芽乳γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度，為開發(fā)新型的高營養(yǎng)功能食品提供技術支持。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

菌種，植物乳桿菌S-35(LactobacillusplantarumS-35)，由中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院應用微生物研究室提供，分離自農(nóng)家酸漿水[8]；大豆種子(2016年秋季收獲)，北大荒集團；MRS (de Man, Rogosa and Sharpe)合成培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、四硼酸鈉、次氯酸鈉、氯化鈉、苯酚、無水乙醇均為分析純，由西隴化工股份有限公司提供。

1.2　儀器與設備

UV-1800型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；YXQ-LS-SⅡ型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DNP-9102型恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司； S23C型pH計，上海雷磁儀器廠；3K15型臺式高速離心機，五洲東方科技發(fā)展有限公司；SCL-1300型超凈工作臺，北京賽伯樂儀器有限公司；SPX-250B-Z型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠； 101型鼓風干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；DYJ-S6365型芽苗菜種植機，廣東小熊電器有限公司；JYL-C010型九陽料理機，九陽股份有限公司。

1.3　試驗方法

1.3.1豆芽乳的制備

精選大豆，清洗，0.25%次氯酸鈉溶液浸泡30 min(除去大豆種子表面的微生物)， 用無菌水清洗后，放入發(fā)芽機發(fā)芽，觀察每天的發(fā)芽狀況，分別取出1、2、3、4、5 d的豆芽制備豆芽乳。

豆芽用清水漂洗， 然后用95℃熱水浸泡3 min，殺酶鈍化， 熱磨(水溫80℃)， 均質(zhì)，加水過濾，調(diào)整豆芽乳干物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)10%， 添加 6%蔗糖[9]，充分攪拌均勻后分裝， 90℃、30 min處理后待用。

1.3.2豆芽乳發(fā)酵試驗

將不同發(fā)芽時間的豆芽乳， 分別接種3%發(fā)酵劑，于37℃培養(yǎng)，觀察凝固狀態(tài)，記錄凝乳時間， 計算乳酸菌活菌數(shù)及γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度。

1.3.3豆芽乳發(fā)酵的單因素試驗

(1)乳酸菌接種量

以植物乳桿菌S-35(5.8×109CFU/mL)為試驗對象，在發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時間為24 h的條件下，研究不同的接種量(1%、2%、3%、4%、5%)對試驗結果的影響，以不同接種量下的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為試驗指標。

(2)發(fā)酵時間

發(fā)酵條件為上述單因素試驗選出的最佳水平，研究不同的發(fā)酵時間(12、24、36、48、60 h)對試驗結果的影響，以不同發(fā)酵時間的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為試驗指標。

(3)發(fā)酵溫度

發(fā)酵條件均為上述單因素試驗選出的最佳水平，研究不同的發(fā)酵溫度(25、28、31、34、37℃)對試驗結果的影響，以不同發(fā)酵溫度的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為試驗指標。

1.3.4響應面法優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵工藝的試驗

在單因素試驗的基礎上，采用中心組合設計(CCD)方法，進行三因素三水平的響應面試驗，以接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為自變量， γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為響應值，采用響應面統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0.6確定最佳發(fā)酵工藝條件。

1.3.5GABA的提取方法

采用2倍體積的60%乙醇進行提?。惶崛l件為70℃恒溫水浴回流2 h； 10 000 r/min離心10 min，取上層清液測定[10]。

1.3.6GABA的檢測方法

采用Berthelot 反應測定GABA的質(zhì)量濃度[10]。

取不同質(zhì)量濃度的GABA標準液0.4 mL，加0.2 mol/L(pH 值9.0)硼酸鹽緩沖液0.6 mL，搖勻，加5%苯酚溶液2 mL，搖勻，加質(zhì)量分數(shù)6%次氯酸鈉溶液1 mL，搖勻，放入沸水浴加熱5 min，立即置冰浴中5 min，待溶液出現(xiàn)藍綠色后，加入2.0 mL 60%酒精，在645 nm處測定溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，GABA的質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。把處理的樣品按以上方法測吸光度，代入標準曲線求出樣品中GABA的質(zhì)量濃度。

以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L質(zhì)量濃度的GABA標準液制作標準曲線，如圖1所示。由圖1可知，吸光度與γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度高度相關，R2=0.998 8，二者之間的關系滿足回歸方程

y=0.124x+0.004 5。

圖1　GABA標準曲線Fig.1　GABA standard curve

1.3.7乳酸菌活菌數(shù)的測定

將不同條件發(fā)酵豆芽乳，分別用滅菌生理鹽水制備10倍系列稀釋樣品勻液，選擇適宜稀釋度的樣品勻液，分別吸取1 mL于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，計算每皿中的菌落數(shù)，求其平均值，乘以稀釋倍數(shù)，乳酸菌活菌數(shù)以CFU/mL為單位。

1.3.8產(chǎn)品感官評價

感官評價評分標準見表1。

由5名男性和5名女性組成感官鑒評小組，并接受感官鑒定培訓。小組成員對發(fā)酵豆乳的色澤、組織狀態(tài)、氣味和滋味以及綜合接受程度指標進行評價。將5項的平均分作為感官評分。計算總分得出結論，60分以上即為可接受，80分以上為風味優(yōu)良，60分以下為不可接受。

表1　感官評價評分標準Tab.1　Scoring criteria of sensory evaluation

1.3.9數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均為平行測定 3 次以上取平均值，并計算出正負標準偏差，用誤差線表示。采用Design-Export 8.0.6 數(shù)據(jù)處理軟件對試驗結果進行處理，應用中心點法對各組變量的計算結果進行方差分析和差異顯著性分析，P<0.05 表明分析結果的差異性顯著，P<0.01表明分析結果的差異性極顯著。

2　結果與分析

2.1　黃豆發(fā)芽時間的確定

發(fā)芽時間為0～5 d的豆芽乳，分別接種3%發(fā)酵劑，于37℃培養(yǎng)，在20～24 h凝乳較好。由表2可知，發(fā)酵豆芽乳的感官品質(zhì)和γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度與豆芽的發(fā)酵時間密切相關。與其他發(fā)芽時間的大豆相比，發(fā)芽1 d的豆芽發(fā)酵乳明顯地提高了γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度，并改善了感官品質(zhì)。發(fā)芽0 d的豆芽發(fā)酵乳有明顯的豆腥味，而豆腥味是豆乳消費量遠低于牛奶的重要原因。當發(fā)芽時間過長時，隨著大豆蛋白在萌發(fā)過程中被內(nèi)源酶的進一步降解，導致發(fā)酵豆芽乳凝乳不完全、青芽味逐漸顯現(xiàn)、口感差，不適用于制作發(fā)酵豆芽乳。因此，選擇發(fā)芽1 d的大豆芽進行后續(xù)試驗。

表2　不同的大豆發(fā)芽時間對發(fā)酵豆芽乳的影響Tab.2　Effects of different germination time on fermented milk with sprouted soybeans

2.2　酸豆芽乳發(fā)酵的單因素試驗

2.2.1植物乳桿菌S-35接種量

固定發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時間20 h，考察接種量對γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的影響。由圖2可知，隨著接種量的升高，GABA質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在接種量為3%時，GABA質(zhì)量濃度達到最大值，為0.66 g/L。中心組合試驗選取的接種量范圍為2%～4%。

圖2　接種量對GABA質(zhì)量濃度的影響Fig.2　Effects of various inoculation percentages on GABA yields

2.2.2發(fā)酵時間

固定發(fā)酵溫度37℃、接種量為3%，考察發(fā)酵時間對γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的影響。由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的增加，GABA質(zhì)量濃度呈先上升后緩慢下降的趨勢。在發(fā)酵時間為24 h時，GABA質(zhì)量濃度達到最大值，為0.71 g/L。中心組合試驗選取的發(fā)酵時間范圍為12～36 h。

圖3　發(fā)酵時間對GABA質(zhì)量濃度的影響Fig.3　Effects of time on GABA yields

2.2.3發(fā)酵溫度

固定發(fā)酵時間為24 h、接種量為3%，考察發(fā)酵溫度對γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的影響。由圖4可知，溫度較低時，GABA的積累量較低，隨著溫度逐漸升高，GABA的產(chǎn)量也明顯升高，當溫度為34℃時，GABA質(zhì)量濃度達到最大值，為1.57 g/L，溫度繼續(xù)升高后，GABA的產(chǎn)量有所減少。GABA的生物合成與谷氨酸脫羧酶的活性密切相關，而酶的生物活性會受到環(huán)境溫度的影響。適宜的發(fā)酵溫度不僅有利于菌體細胞的生長繁殖，同時還會增加酶的生物活性，促進酶促反應的進行[11]。溫度調(diào)整到34℃進行發(fā)酵，谷氨酸脫羧酶的生物活性能夠充分發(fā)揮，使GABA大量的積累。中心組合試驗選取的發(fā)酵溫度范圍為31～37℃。

圖4　發(fā)酵溫度對GABA質(zhì)量濃度的影響Fig.4　Effects of various temperatures on GABA yields

2.3　響應面優(yōu)化試驗結果與分析

2.3.1響應面模型試驗方案及結果

根據(jù)CCD的中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，選取植物乳桿菌S-35接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度3個因素為CCD的自變量進行響應面優(yōu)化。由單因素試驗優(yōu)化出的接種量3%、發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵溫度34℃為中心點進行試驗。以發(fā)酵產(chǎn)品中γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為響應值，試驗因素與編碼見表3。根據(jù)表3進行三因素三水平響應面試驗，具體試驗方案及結果見表4。表中A、B、C分別為接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度的編碼值，Y為GABA質(zhì)量濃度。

表3　旋轉中心組合設計因素編碼Tab.3　Level of factors in central composite design

表4　響應面旋轉中心組合(CCD)設計與試驗結果Tab.4　Design and results of central composite design

2.3.2響應面模型的分析

以發(fā)酵產(chǎn)品中γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為響應值，由軟件Design-Expert 8.0.6 進行分析，得到的結果見表5。

經(jīng)回歸擬合后，根據(jù)各項的回歸系數(shù)，刪除不顯著項得到的模型方程為

Y=1.57+0.13A+0.13B+0.044C+0.019AB+
0.064AC-0.029BC-0.18A2-0.31B2-0.31C2

由表5的方差分析可得，該模型達到極顯著的水平(P<0.000 1)。同時，該模型的失擬度不顯著(P>0.1)，可見此方程與實際數(shù)據(jù)擬合性良好，試驗設計可靠，適用于發(fā)酵體系條件的優(yōu)化。信噪比為81.367，遠大于4，因此該模型可用于預測試驗數(shù)據(jù)。決定系數(shù)R2=0.998 9，校正決定系數(shù)R2=0.997 9，說明該模型的變量與自變量之間關系顯著，模型合理可用。

圖5為Design-Expert 8.0.6做出的兩因素自變量對γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度交互作用的3D 響應曲面圖，可知植物乳桿菌接種量與發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度、植物乳桿菌接種量與發(fā)酵時間響應面三維圖均有穩(wěn)定點，且為極大值。

表5　響應面旋轉中心組合設計(CCD)回歸模型方差分析Tab.5　ANOVA of central composite design

注：** 表示極顯著水平P<0.01，*表示顯著水平P<0.05。

圖5　兩因素對γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的響應曲面Fig.5　Response surface diagrams of two factors on GABA yields

通過響應面分析，得到植物乳桿菌發(fā)酵體系最佳工藝條件是接種量3.41%、發(fā)酵時間26.68 h、發(fā)酵溫度34.31℃，在此條件下γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的預測值為1.62 g/L。為了便于實際操作，對優(yōu)化條件的參數(shù)取整后，接種量為3.5%，發(fā)酵時間為27 h，發(fā)酵溫度為34.5℃。為檢驗響應面模型的可靠性，按上述最佳工藝條件重復3 次試驗，驗證試驗得到的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為1.61 g/L， 與理論預測值相比，相對誤差為0.6%，可見通過響應面優(yōu)化方法得到的發(fā)酵體系最佳工藝條件是可靠的。驗證試驗得到的發(fā)酵豆芽乳凝固狀態(tài)均勻，乳清析出少，且有濃郁的發(fā)酵香味，風味純正，無異味。經(jīng)測定最大活菌數(shù)為1.60×109CFU/mL。

2.4　儲藏穩(wěn)定性試驗

將發(fā)酵豆芽乳在4℃下冷藏，評價了冷藏過程中豆芽乳品質(zhì)的變化。由圖6可知，乳酸菌的活菌數(shù)在儲藏過程中逐漸下降。但在1～7 d時，活菌數(shù)均大于108CFU/mL，符合乳酸菌發(fā)酵飲料要求。由圖7可知，pH值整體呈下降趨勢，但是變化較小。這與預期目標一致，篩選的菌種較為合適，后酸化現(xiàn)象較輕。

圖6　4℃儲藏過程中發(fā)酵豆芽乳活菌數(shù)的變化Fig.6　Changes of viable bacterium in fermented sprouted soymilk during storage at 4℃

圖7　4℃儲藏過程中發(fā)酵豆芽乳pH值的變化Fig.7　Changes of pH value in fermented sprouted soymilk during storage at 4℃

根據(jù)表6，在發(fā)酵豆芽乳儲藏期間，發(fā)酵豆乳的感官評分逐漸下降，4℃冷藏1 d時感官評分為90，呈乳白色；組織均勻、細膩、凝塊結實；無豆腥味、有發(fā)酵豆乳特有香氣；酸甜適中；整體感覺較為理想。1～3 d儲存期內(nèi)品質(zhì)基本不變。冷藏7 d時感官評分為60，有一定的乳清析出、顏色稍黃、滋味平淡，整體可接受。綜上，認為在4℃冷藏條件下，1～3 d儲存期內(nèi)品質(zhì)優(yōu)良，1～7 d內(nèi)豆乳綜合品質(zhì)較為穩(wěn)定。

表6　感官評價分數(shù)Tab.6　Scoring of sensory evaluation

3　討論

許多國內(nèi)外學者對乳酸菌產(chǎn)GABA的研究進行了報道，并認為乳酸菌是可食用型GABA的良好來源。大多數(shù)乳酸菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的報道為合成培養(yǎng)基水平的優(yōu)化，如L.plantarumATCCl4917，以化學限定培養(yǎng)基為基礎，發(fā)酵初始pH值為5.5，發(fā)酵溫度為37℃，L-谷氨酸鈉濃度為100 mmol/L，接種量為3%，發(fā)酵36 h時，添加L-谷氨酸鈉發(fā)酵液中GABA濃度為721.35 mmol/L[12];L.plantarumMJ0301，葡萄糖質(zhì)量濃度為16 g/L、氮源(胰蛋白胨、酵母膏質(zhì)量比1∶1)質(zhì)量濃度為10 g/L、L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為30 g/L、檸檬酸三胺質(zhì)量濃度為2 g/L、K2HPO4質(zhì)量濃度為2 g/L 、乙酸鈉質(zhì)量濃度為5 g/L、硫酸鎂質(zhì)量濃度為0.1 g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度為0.05 g/L、吐溫80體積比為1 mL/L。此時，L.plantarumMJ0301產(chǎn)GABA的質(zhì)量濃度為1.59 g/L[13]。也有一些研究者對乳酸菌在天然培養(yǎng)基中的γ-氨基丁酸的產(chǎn)量進行了報道。如SONG等[14]研究了L.rhamnosusGG赤豆乳中產(chǎn)γ-氨基丁酸的情況(干物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為5%)，添加了1.44%半乳糖， 2.27% L-谷氨酸鈉和0.20%維生素B6，以1%的接種量(種子液的菌數(shù)為108CFU/mL)，37℃，培養(yǎng)36 h的條件下，γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度為1.12 mg/mL。L.brevisBJ20海帶提取物發(fā)酵液中，γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度為2.465 mg/L[15]。高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌不僅與它們的GAD活性有關，而且與食物基質(zhì)中谷氨酸、GAD輔酶(磷酸吡哆醛)的濃度有關[15]，高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌有開發(fā)功能性食品的潛力。

目前，多數(shù)對乳酸菌GABA產(chǎn)量優(yōu)化的研究主要從增強GAD活性入手，其中重要的影響因素有底物谷氨酸或谷氨酸鹽的濃度、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、環(huán)境pH值和發(fā)酵基質(zhì)等。在本研究預試驗中，發(fā)現(xiàn)外源添加的L-谷氨酸鈉對發(fā)酵體系的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度沒有影響，可能是由于豆芽乳本身含有的谷氨酸對于植物乳桿菌來說已經(jīng)足量。GABA常在乳酸菌發(fā)酵的穩(wěn)定后期達到最大值，發(fā)酵終點的酸度和營養(yǎng)匱乏程度影響到GABA的產(chǎn)量[16]。在特定發(fā)酵時間內(nèi)，接種量的變化會影響穩(wěn)定后期的發(fā)酵參數(shù)，從而影響GABA的產(chǎn)量。GAD酶的含量和活力會直接影響GABA的產(chǎn)量。在發(fā)酵時間單因素優(yōu)化試驗中，0～24 h范圍內(nèi)，隨著菌體量的增多，GAD的質(zhì)量濃度不斷增加，發(fā)酵乳pH值逐漸偏酸性，而乳酸菌GAD的最適pH值是偏酸性的，因此，GABA質(zhì)量濃度不斷增加。在發(fā)酵24 h后，GABA質(zhì)量濃度開始下降，這可能是由于發(fā)酵體系的pH值不再適合谷氨酸脫羧酶的活性范圍，乳酸菌GABA-T活性增加了GABA分解代謝的作用；另一方面外界環(huán)境刺激時，GABA的產(chǎn)生是細菌的一種自我防護機制，用來緩解壓力和提高細菌存活力[17]。在延長發(fā)酵時間的情況下，乳酸菌代謝產(chǎn)生GABA可能作為能量來源被消耗[18]。發(fā)酵溫度不僅影響GAD的催化活性，同時影響菌體細胞的生長和繁殖，因此發(fā)酵溫度也是影響乳酸菌發(fā)酵過程中GABA積累量的關鍵因素。由于不同乳酸菌中GAD的性質(zhì)不同，所以GABA最大積累時發(fā)酵溫度具有種屬特異性。一般來說，乳酸菌GAD的最適pH值是偏酸性的，最適溫度在30～37℃的范圍內(nèi)。CHOI等[19]對一株乳酸短桿菌產(chǎn)GABA的發(fā)酵條件進行初步優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度為32℃時，該乳酸短桿菌合成GABA的量最大[19]。L.brevisGABA057能在高酸性的環(huán)境下(pH值約為4.2)將10%的底物轉化成GABA[20]，然而此時的酸性環(huán)境已經(jīng)不適宜菌體的生長。

L.plantarum能夠耐胃酸和膽汁消化，黏附并定植于宿主腸道上皮細胞內(nèi)，發(fā)揮多種有助于宿主健康的益生功能，因此常作為益生菌應用于發(fā)酵食品和保健品中。利用植物乳桿菌發(fā)酵果蔬，改善果蔬中活性成分組成，開發(fā)功能性飲品的研究已十分廣泛[21]。L.plantarum能夠利用谷氨酸或其鹽類，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生GABA是其諸多生理功能中的重要一項。在大豆發(fā)芽過程中，蛋白質(zhì)和氨基酸含量都有顯著的變化，大豆的營養(yǎng)價值得以提高。發(fā)芽本身還可以去除部分“豆腥味” ，發(fā)芽不僅會使豆乳變得更益于人類健康，而且可能會促進乳酸菌發(fā)酵和γ-氨基丁酸的產(chǎn)生。 胡東良等[22]研究了乳酸菌豆芽乳發(fā)酵特性，結果表明， 乳酸菌在豆芽乳中生長良好，使豆芽乳pH值下降， 產(chǎn)生凝乳作用。崔蕊靜等[23]采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵豆芽乳，制成的酸豆奶風味獨特，富有清香味，營養(yǎng)豐富，色澤近似酸牛奶，是一種優(yōu)良的功能性乳制品。這也證明了開發(fā)富含γ-氨基丁酸的乳酸菌發(fā)酵豆芽乳，有一定的實際應用價值。

4　結論

(1)研究了接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度對豆芽乳發(fā)酵體系中γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的影響。在單因素試驗的基礎上，采用CCD 設計，以γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為響應值，進行響應面優(yōu)化試驗，利用Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出發(fā)酵體系模型，并對試驗結果進行預測。在此模型中，各因素對發(fā)酵乳的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度均有顯著的影響。且發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度之間的交互作用極顯著(P<0.01)，植物乳桿菌接種量與發(fā)酵溫度、植物乳桿菌接種量與發(fā)酵時間之間的交互作用顯著(P<0.05)。發(fā)酵體系的最佳工藝條件是接種量3.5%、發(fā)酵時間27 h、發(fā)酵溫度34.5℃。在此條件下γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度預測值為1.62 g/L，試驗驗證值為1.61 g/L。

(2)豆芽發(fā)酵乳凝固狀態(tài)均勻，乳清析出少，且有濃郁的發(fā)酵豆乳味香，風味純正，無異味，發(fā)酵乳的pH 值為4.6，最大活菌數(shù)為1.60×109CFU/mL。在4℃條件下貯藏1～3 d內(nèi)，品質(zhì)基本無變化，各項指標優(yōu)良。1～7 d內(nèi)綜合品質(zhì)達標。可見通過響應面優(yōu)化法與模型的建立得到的發(fā)酵體系最佳工藝條件對實際生產(chǎn)具有指導意義。

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