循環腫瘤細胞研究進展及其在胰腺癌診療中的應用
2018-04-02 03:20:07
復旦學報(醫學版) 2018年1期
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(1復旦大學附屬中山醫院介入治療科 上海 200032; 2上海市影像醫學研究所 上海 200032)
循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)是一種由原發腫瘤組織脫落入血循環的腫瘤細胞[1]。CTCs進入血液循環后,絕大部分經脫巢凋亡(anoikis)、血流剪應力和機體免疫識別殺傷,最終能在外周血中存活的CTCs數量很少,通常為1～102/mL(白細胞數量為105～106/mL,紅細胞數量為109～1010/mL)。目前研究認為,CTCs和多個CTCs形成的團簇在腫瘤轉移中起到關鍵作用[2]。CTCs在傳播過程中的表面抗原、基因型及其病理學表征是當前癌癥轉移機制的研究要點。以CTCs技術為代表的“液體活檢”取樣簡易且微創,能更好地代表腫瘤的異質性,已被視為一種新型的腫瘤生物標記物。CTCs計數、計數變化、亞群特征等與患者預后密切相關,并與個體化治療建立起越來越多的聯系。利用CTCs的功能性診斷結果建立個性化癌癥治療方案,是實現癌癥精準用藥重要而可靠的途徑。本文就CTCs的研究進展及其在胰腺癌診療中的應用作一綜述。
CTCs的分離CTCs的分離方法按照分離原理可以分為生物法和物理法兩大類[3]。生物法利用CTCs不同于其他血細胞(白細胞、紅細胞、血小板)的表面抗原,物理方法則根據CTCs與其他血細胞在密度、尺寸、變形性方面的差異。將患者血樣中的紅細胞裂解后,采用表面固定的EpCAM抗體直接識別并捕獲表達EpCAM抗原的CTCs,獲得的CTCs即可進行顯色分析,這種分離方法屬于生物法中的陽性富集。CellSearch系統是這一分離技術的代表,是目前唯一經FDA認準用于轉移性乳腺癌、結腸癌和前列腺癌預后判斷的CTCs分離系統[4-6]。使用表面帶有白細胞特異性抗體的磁珠吸附白細胞,獲得未標記的CTCs懸浮液,這種方法又稱為生物法中的陰性富集[7]。物理法中,OncoQuick系統不依賴抗原的識別,而是通過CTCs和其他血細胞的密度不同加以分離,因此可以獲得EpCAM陽性和陰性的CTCs[8]。MetaCell系統的技術核心是利用CTCs的直徑大于其他血細胞的特點,將血樣通過孔徑為8 μm的聚碳酸脂膜,過濾分離CTCs[9]。Hou等[10]根據流體力學原理設計了螺旋形微管道,通過慣性微流與Dean環流的耦合分離CTCs與白細胞。Yeo等[11]在這一基礎上,進一步設計了能分離出單個CTC的微流控設備,使獲得的CTCs可以直接用于下游分子生物學檢測。目前,也有納米技術應用于CTCs分離的報道。Halo等[12]將與CTCs中特定基因(如TWIST) mRNA互補的單鏈DNA附著于金納米顆粒表面,當納米顆粒進入CTCs時,兩者結合時釋放熒光,根據熒光強度可半定量檢測CTCs。需要注意的是,不同原理、不同的分離體系的CTCs檢出率和純度會相差很大。如Kaifi等[13]的研究中,同時使用基于抗原的CellSearch系統和基于尺寸的FMSA系統分別檢測圍術期CTCs時,FMSA系統的檢測率高達93.4%,CTCs平均數為22.56個/7.5 mL,而CellSearch系統僅為26.1%和0.87個/7.5 mL。基于抗原識別的生物方法具有高純度的優勢,但會遺漏不表達相應抗原的CTCs,而且因抗原抗體的作用,有可能影響下游功能檢測;基于密度和尺寸的物理分離方法,不受CTCs表面抗原表達的影響,檢出率較高,但因可能混雜其他血細胞而導致純度較低。CTCs分離技術發展很快,很多較成熟的體系已經具備較快的樣品處理速度和較高的檢出率、檢出純度。目前急需的是相應的技術規范和操作標準,以便臨床應用研究和實驗研究的規范化和標準化。
CTCs的分子生物學特征隨著CTCs分離技術的不斷改良,基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等生物學成果的涌現,為揭示CTCs的分子生物學特征及其在腫瘤轉移發生發展中的作用提供了可能。
上皮-間質轉化 上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉化為間質表型細胞的生物學過程[14]。在這個過程中,腫瘤細胞失去極性、黏附性等上皮表型,轉化為具有較高運動、侵襲能力的間質表型,從而大大提升了腫瘤細胞侵襲轉移的能力[15]。現有研究表明,上皮細胞源性腫瘤細胞在SNAI1、ZEB、MMP9、TWIST等家族轉錄因子作用下,E-鈣黏蛋白表達受到抑制,發生EMT,失去極性與細胞黏附性,從原位腫瘤組織脫落并進入血液循環系統[16]。進入循環系統的CTCs大部分發生凋亡,或在免疫編輯作用下進入休眠狀態,24 h后僅約0.1%的CTCs仍存活,其中不足1/10具有致瘤性[17]。EMT是一個受多種因子和信號通路調控的復雜過程,它的具體機制還有待于進一步研究加以闡明。IL-6長期以來被認為有促進結直腸惡性腫瘤EMT的功能。Liu等[18]證實了fos相關抗原-1 (Fra-1)和信號轉導及轉錄激活子3 (singnal transducer and activator of transciption 3,STAT3)共同調控IL-6誘導EMT過程。在用RNA干預STAT3或IL-6的表達后,EMT、細胞遷移、組織侵犯等現象都受到阻礙。轉錄因子NF-κB調控廣泛的生物過程,包括炎癥反應、細胞擴增、細胞凋亡等。Maier等[19]發現NF-κB受抑制時,轉變生長因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)誘導的EMT無法發生,而活化NF-κB后,細胞呈現出波形蛋白和ZEB1的上調控及E-鈣黏蛋白的下調控等EMT特征。Gu等[20]發現肺癌細胞中IL-17經NF-κB介導上調控ZEB1,誘發EMT。基于對EMT的調節信號網絡結構分析,Chanrion等[21]提出并驗證了p53的丟失和Notch激活協同誘導EMT。Yang等[22]發現巖藻糖轉移酶能激活P13K/Akt和NF-κB通路,進一步激活SNAI1和MMP-9誘導EMT。Salnikov等[23]證明低氧環境會正調節EMT相關基因,使得E-鈣黏蛋白表達量降低,波形蛋白表達量升高。Zheng等[24]利用敲除了Snai1或Twist的基因工程鼠,證明了EMT的抑制并不改變胰管腺癌的發生、擴散和轉移,但導致均衡核苷轉運蛋白和集中核苷轉運蛋白過表達,進而提高了對化療藥物吉西他濱的敏感性和整體存活率。
CTCs的保護機制 進入血液系統,CTCs將受到血液剪應力、免疫細胞殺傷等滅活作用。在傳播過程中CTCs采取多種機制自我保護,包括利用血小板為保護屏障、回避免疫識別等方式。腫瘤細胞在血液中與血小板聚合,可抵御血液流動的剪應力。Zheng等[25]發現血小板和腫瘤細胞均表達纖維蛋白原的主要受體——β整合蛋白,纖維蛋白原能將兩者橋連,加強兩者的結合,促進對CTCs的保護。肝素及其化學衍生物可以抑制纖維蛋白原與β整合蛋白的結合,具有發展為抗癌癥轉移藥物的潛力。免疫識別方面,CD47是一種廣泛表達的跨膜蛋白,可與巨噬細胞、樹突細胞等表達的單調控蛋白α結合抑制其吞噬作用,Willingham等[26]系統地分析了人體各部位(包括卵巢、乳腺、結腸、膀胱、前列腺等)惡性腫瘤細胞的CD47表達量,發現腫瘤細胞的CD47表達量平均約為相應正常細胞的3.3倍。同一研究發現CD47 mRNA水平與患者無進展生存期(progression-free survival,PFS)負相關,而抗CD47抗體使吞噬作用恢復,進一步證明了CD47的高表達能夠降低免疫系統對CTCs的殺傷。單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)是一種能夠吸引自然殺傷細胞(natural killer cells,NK)、記憶T淋巴細胞等免疫細胞的趨化因子,與腫瘤的生長與擴散相關。Mardani等[27]分析比較了健康志愿者、良性/惡性唾液腺腫瘤患者血清樣品中的MCP-1濃度,發現高進展患者的血樣中MCP-1濃度較低,認為低濃度MCP-1為腫瘤的擴散提供了有利條件。NK細胞是一類通過穿孔蛋白和顆粒酶直接殺死腫瘤細胞,或通過調控干擾素γ (interferon γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)等因子間接消滅腫瘤細胞的免疫細胞,是人體免疫系統中重要的抗癌細胞,其激活依賴于多種蛋白質受體。Rocca等[28]發現外周血中NK細胞表面的CD16、NKG2D、DNAM-1、CD161、NKp46、NKp30等激活受體表達受到負調節,而CD85j、NKG2A等抑制受體受到正調節,使得NK細胞的細胞毒性作用與IFN-γ分泌量均下降,推測在癌癥擴散過程中,NK細胞活性降低導致循環系統中腫瘤細胞的存活能力增強。蛋白酶激活受體-1 (protease activated receptors-1,PAR-1)在乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤細胞等表面的過表達也與其轉移能力增強相關。Villares等[29]發現PAR-1負調控乳腺絲抑蛋白質的水平,而后者能增加腫瘤細胞的細胞凋亡、減少腫瘤血管生成。在充分了解CTCs躲避免疫系統攻擊的分子水平機制后,有可能利用人體自身免疫干預腫瘤轉移的發生和發展。
異質性 腫瘤組織具有異質性(如突變位點、細胞表型不同),CTCs不僅具有同樣的異質性,還可能成為研究腫瘤異質性的有效工具。Li等[30]以角蛋白8、18、19及EpCAM為上皮細胞(E)標志物,以波形蛋白和TWIST為間質細胞(M)標志物,對胃癌患者CTCs進行染色,將CTCs分為5類(E,E>M,E=M,E
干細胞特征 研究表明,CTCs中只有少部分細胞能夠形成腫瘤,這些細胞被認為具有干性,或稱為腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)。CD133被視為胰腺癌干細胞標記物,Nomura等[35]研究CD133過表達的胰腺癌細胞,發現諸多被認為與干性相聯系的基因(如KITLG、LIN28B、MYC、SOX2等基因)以及與EMT相關的基因,(如SNAI1、ZEB1、MMP9等)均上調;CD133過表達的細胞用于異種移植時,成瘤率和腫瘤生長速率均顯著提升。Grillet等[36]將轉移性結直腸癌患者CTCs建株,檢測到其ALDH1A1、CD133、EpCAM、CD26、CD44v6等蛋白質高含量,結合極限稀釋分析結果,認為所得細胞株中CSC的比例低于5%。Salnikov等[24]在多種惡性腫瘤(如胰管腺癌、乳腺癌、肺癌等)中,發現低氧標志物HIF-2α陽性區域也是CD133陽性區域。他們還證明低氧環境能提高腫瘤細胞的遷移能力,而將腫瘤細胞按分化程度、p53突變、群落形成能力等參數劃分為CSC高表達亞群和CSC低表達亞群后,發現CSC高表達亞群的基礎遷移能力與低氧誘導的遷移能力均高于CSC低表達亞群,由此認為CSC是組織侵入和癌癥轉移的根源。CSC具有特殊的增殖能力和抗藥性,在癌癥擴散和復發中都起到關鍵作用。以CTCs為載體系統地研究CSC是腫瘤生物學今后發展的重中之重。
CTCs的培養擴增臨床血樣中可采集到的CTCs數量極少,除能進行細胞計數與基因測序外,通常不足以用于常規的藥敏性測試或細胞表型分析,故CTCs的穩定培養擴增是CTCs下游功能的分析的基礎。同時,在細胞數量很少的情況下,細胞間的旁分泌信號匱乏,會增加細胞培養擴增的困難。 Yu等[37]通過CTC-ichip采集雌激素受體陽性乳腺癌患者的CTCs,用加入了表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、基本纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、B27添加劑的RPMI-1640培養基,在超低黏附多孔板中及低氧(4%O2)條件下,成功將17.14% (6/35)的樣品CTCs增殖,倍增時間為3天至3周,同時還報道了貼壁會誘使CTCs衰老這一現象。Cayrefourcq等[38]用CellSearch系統采集轉移性結直腸惡性腺癌患者的CTCs懸浮培養,先置于加入了胰島素、左旋谷氨酸鹽、EGF、FGF-2、N2添加劑、少量胚胎牛血清的DMEM/F12培養基中,低氧(2%O2)條件下培養,后轉移到加入了EGF、FGF-2、胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑的RPMI-1640培養基中,常氧條件下培養,得到能夠長期存活的細胞株。Gao等[39]用Ficoll?Paque系統離心得到轉移性前列腺癌患者的CTCs,分散在Matrigel中為類器官,浸泡于加入了多種添加劑的DMEM/F12培養基中,將5.88% (1/17)的樣品成功擴增,倍增時間為1周,突變情況和結構分別與原位腫瘤細胞和組織相似。Zhang等[40]用CTC-chip固定早期肺癌患者外周血中的CTCs,先在芯片上加入纖維組織母細胞和膠原、Matrigel,浸泡在添加了胎牛血清的RPMI-1640培養基中3D-共培養1周,腫瘤細胞數量平均提高到8倍;后將細胞從芯片上釋放轉移到多孔板中繼續培養1周,腫瘤細胞數量平均提高到54倍,總培養成功率為73.68% (14/19)。CTCs培養成功率普遍較低是目前面臨的學術難題。目前尚無適用于所有不同來源腫瘤細胞培養的“金標準”,但每一類腫瘤CTCs的成功培養,都將極大地推進腫瘤轉移發生發展的研究和相關臨床治療。
CTCs在胰腺癌診療中的應用中國腫瘤登記中心最新發布結果顯示,2000年至2011年間我國胰腺癌發病率與死亡率逐年攀升,預計2015年全國新發胰腺癌約9萬例,死亡約8萬例[41]。早期診斷困難與缺乏有效的個體化治療方案是導致胰腺癌預后極差的重要原因。80%左右的患者確診時已發生腫瘤外周侵襲或遠處轉移,無法進行手術治療[42]。CA19-9是臨床最重要的胰腺癌血清生物學標記,但敏感性和特異性僅為80%和82%,部分胰腺癌患者CA19-9水平不升高,部分良性疾病(如胰腺炎、膽道梗阻)患者會出現CA19-9水平升高的假陽性[43]。因此,需要尋找新的有效的生物標志物,不僅可以用于胰腺癌的早期診斷,而且可以監測療效,指導臨床治療。CTCs作為液體活檢的重要組成部分,是目前臨床研究的熱點。胰腺的靜脈血首先經門靜脈系統回流至肝臟,然后再到達體循環,外周血CTCs明顯少于乳腺癌、前列腺癌等腫瘤。胰腺癌基質豐富,腫瘤細胞所占比例較少,因此外周血中的CTCs也少于同樣經門靜脈回流的結直腸癌、胃癌[44]。部分研究因胰腺癌CTCs檢出率低、單位血樣中CTCs計數少,而未能得出有意義的結論[45]。
診斷和分期 Kulemann等[46]用Screencell系統檢測的一組胰腺癌病例中,75.0%的早期患者(AJCC分期≤ⅡB期)CTCs陽性,71.4%的晚期患者(AJCC分期≥Ⅲ期)CTCs陽性。因此CTCs并不只出現于轉移或晚期患者,胰腺癌的不同分期都可以出現CTCs。Zhang等[47]采用CK、CD45、DAPI和CEP8(染色體著絲粒探針8)作為標志物檢測了22例胰腺癌、3例胰腺實性假乳頭狀瘤、6例胰腺良性腫瘤患者和30例健康志愿者。將CK(+)、CD45(+)、DAPI(+)和CEP≥2作為胰腺癌CTCs標準時,CTCs計數≥2個/3.75 mL診斷胰腺癌的敏感性和特異性分別達到68.18%和94.87%。Zhou等[48]檢測C-MET、h-TERT、CK20和CEA基因在胰腺癌CTCs中的表達分別為80%、100%、84%和80%,而在正常體細胞中為0、0、6.7%和0。如將上述4個基因表達同時作為胰腺癌CTCs標準時,診斷的敏感性和特異性均可以達到100%。Ankeny等[49]檢測72例胰腺癌患者和28例其他胰腺疾病患者的CTCs,顯示Ⅰ～Ⅱ期患者CTCs陽性率為54.84% (17/31)、Ⅲ期陽性率為78.57% (11/14)、Ⅳ期陽性率為96.30% (26/27);28例其他胰腺疾病患者中僅1例檢測出了1個CTCs;統計表明可以將CTCs≥3個/4 mL作為Ⅳ期胰腺癌的評判標準。CTCs有望成為胰腺癌診斷和分期的生物學標志。
療效和預后 Sheng等[50]觀察了3例接受化療的Ⅳ期胰腺癌患者,采用CT進行療效隨訪的同時,檢測患者的CTCs。當CT顯示治療有效、病灶縮小時,CTCs計數同時下降。因此CTCs計數有可能成為比CT損傷更小的療效觀察指標。Khoja等[51]分別用CellSearch系統(根據上皮表型-EpCAM/CK富集CTCs)和ISET系統(根據細胞大小富集CTCs)獲取54例胰腺癌患者的CTCs,ISET系統的CTCs檢出率為93%,明顯高于CellSearch系統的40%,ISET系統檢測的CTCs中位值為9個/7.5 mL,亦明顯高于CellSearch系統的0個/7.5 mL。這一研究結果表明,CTCs中僅一小部分具有上皮表型,EMT過程使部分CTCs喪失了上皮表型,同時獲得間質表型。只有對所有表型的CTCs進行分析,才能更好地研究腫瘤的異質性。采用CTCs評價患者預后時,應考慮CTCs的EMT現象,也就是不能僅分析上皮表型的CTCs,還應考慮間質表型的CTCs。Poruk等[52]分析了50例胰腺癌患者(其中44例接受外科手術)的CTCs,分別觀察具有上皮表型(角蛋白陽性)和間質表型(波形蛋白陽性)的CTCs對患者預后的影響。他們發現,上皮表型CTCs陽性預示患者生存期較短,間質表型CTCs與術后復發相關,檢測到間質表型CTCs的患者中位復發時間為9.5個月,而間質表型CTCs陰性的患者則為13.5個月。
胰腺癌CTCs的分子生物學 雖然,目前有關胰腺癌CTCs分子生物特征的研究很少,但是這些報道仍顯示出樂觀的研究前景。黏蛋白-1(Mucin-1)是一種和腫瘤轉移有關的跨膜糖蛋白,它的表達預示患者預后較差。目前,已有針對黏蛋白-1的IgG抗體應用于臨床,但是有時病灶穿刺活檢的樣本量太少,無法進行黏蛋白-1的測定。Dotan等[53]對23例CTCs陽性的患者進行了黏蛋白-1表達的觀察,發現10例(43%)黏蛋白-1陽性,黏蛋白-1陽性患者的中位生存期2.7個月,明顯低于黏蛋白-1陰性患者的9.6個月(P=0.044)。因此,通過對CTCs的黏蛋白-1表達分析,可以指導臨床用藥。Court等[54]采用Sanger測序技術對獲取的胰腺癌CTCs進行單細胞測序,在12例患者獲取的119個CTCs中有33個檢測到了KRAS突變,KRAS突變檢出率達到了27.7%。并認為當CTCs數量達到10個以上時,可以用這一單細胞測序技術得到KRAS突變陽性結果。Sergeant 等[55]對CTCs的基因表達進行了深入研究,他們從6例接受手術切除的胰腺癌患者獲得CTCs行RNA擴增后,進行全基因組測序,并和原發腫瘤、血細胞和胰腺組織對比。結果發現CTCs有1 059個基因異常表達,與腫瘤細胞遷移有關的細胞分裂激活激酶p38(p38MAPK)信號通路上調。而且和腫瘤細胞遷移和運動相關基因高表達的數量,直接和患者的無病生存期和總生存期有關。
結語CTCs是探究癌癥發生轉移機制的理想對象,近年來受到臨床熱切關注;CTCs的特征與癌癥預后緊密聯系,有極大的臨床意義。隨著研究方法的不斷進步,對CTCs的認識也從簡單的數量鑒定步入對分子層面的研究。其中,CTCs所表現出的干細胞特征、異質性、免疫逃避機制等特征及其相關的后續臨床應用,對胰腺癌的早期篩查、精準治療和預后判斷都有顯著價值。CTCs在臨床上的推廣運用仍需要對分離獲取方法的標準性、功能性分析的可靠性和前瞻研究的有效性進行更加深入和細致的探究,相信該領域將會是腫瘤學研究的重點之一。
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