根霉透析膜培養(yǎng)技術及其應用

張素琴，司會

（蘇州農業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇蘇州 215008）

在舊時制曲中，根霉的培養(yǎng)多采用固體傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，根霉接種在含水量不超過60%的固體基質上進行生長繁殖，固體基質既是根霉生長代謝的碳源，又是微生物生長的微環(huán)境[1]。這種方法雖然工藝簡單，設備可因陋就簡，在我國已沿襲千年之久，但生產效率低、勞動強度大、產品質量不穩(wěn)定。20世紀70年代，上海工業(yè)微生物研究所和上海藕粉廠聯(lián)合推出液體培養(yǎng)根霉，實現(xiàn)了工業(yè)化、連續(xù)化生產，但液體深層發(fā)酵工藝要求高，操作尤其嚴格，設備投資一次性較大，難以掌握推廣[2]。20世紀80年代，蘇州市第二米廠采用液、固結合法培養(yǎng)根霉，節(jié)省了菌種，擴大了生產規(guī)模。為提高生產效率，克服根霉在固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)中的不足，借鑒無土栽培蔬菜的原理，經過不斷探索和試驗，提出了根霉透析膜培養(yǎng)技術，該方法兼具固、液體培養(yǎng)各自的優(yōu)點，同時又避免它們的某些缺陷，實際上是固態(tài)培養(yǎng)、液態(tài)培養(yǎng)的折中法[3]。所謂透析培養(yǎng)是通過透析膜調節(jié)物質轉移而進行的微生物培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)單菌種時，則在兩相的一方培養(yǎng)微生物，另一方則作為培養(yǎng)基貯槽，營養(yǎng)物質的擴散和生物量的累積是在兩相之間的透析膜上進行的，其優(yōu)點是可以增加生物量的積累，達到很高的細胞密度，同時可節(jié)省培養(yǎng)基原料，提高菌體收率。微生物的透析膜培養(yǎng)技術在國外已有數(shù)十年歷史，在我國還鮮有報道，尚未有專題研究，現(xiàn)將根霉透析膜培養(yǎng)技術試驗成果和應用價值報道如下。

1 根霉培養(yǎng)特性的研究

根霉在固體培養(yǎng)基上進行無性繁殖過程，孢子發(fā)芽長出芽管，接著伸出絮狀菌絲，在營養(yǎng)豐富的麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，菌絲沿斜面表面蔓延伸展，匍匐菌絲粗壯發(fā)達，形成較厚的膜層，菌落初為白色透明，老熟后仍呈白色。在菌絲布滿斜面后，在沿試管壁靠近培養(yǎng)基處，會有少許菌絲沿管壁攀爬伸展，因此可以推斷在試管壁上能夠沿伸生長的菌絲體，是依靠扎根在培養(yǎng)基內的基內菌絲輸送營養(yǎng)。

根霉在液體培養(yǎng)基內是由兩個生理上不同而且有一定親和力的菌絲結合在一起，形成初生配子囊，吸收養(yǎng)分，逐漸成熟形成結合體新細胞，再進行繁殖，即為有性繁殖。此外，初生菌絲體延長，被攪拌斷裂后又延伸生長，液體培養(yǎng)收率高，生物量高于固體培養(yǎng)，但工藝要求高。實驗發(fā)現(xiàn)，在三角搖瓶液體振蕩培養(yǎng)中，因振蕩被甩到瓶壁上的菌液仍能沿瓶壁生長，形成菌膜。

通過以上兩個試例可以了解根霉菌絲體在固體表面上生長迅速，有較強的攀爬延伸能力，形成菌絲體膜層，這就為透析膜培養(yǎng)打下基礎，應用透析膜培養(yǎng)技術可以將固、液體培養(yǎng)整合在一起，放在一個環(huán)境中進行。

2 根霉透析膜培養(yǎng)原理

利用透析膜將兩相隔開，方法是在液體培養(yǎng)基上放置一塊透析膜，微生物點種在透析膜上，營養(yǎng)物質經擴散滲透至透析膜，而微生物通過透析膜吸取營養(yǎng)，在膜固體表面上生長延伸，累積生物量，即營養(yǎng)依靠液體輸運，而菌的培養(yǎng)生長則在膜固體表面上進行，將液、固培養(yǎng)有機結合。

3 根霉透析膜培養(yǎng)方法

3.1 材料

根霉M101（上海工業(yè)微生物研究所）、麥芽汁（自制，大麥發(fā)芽，搗碎，糖化，去渣，過濾沉清，調整濃度為14°Bé）、再生纖維素透析膜、500 mL克氏瓶。

3.2 方法

另裁剪一塊比克氏瓶底面積稍大的纖維素膜作為透析膜，取500 mL克氏瓶，裝液量約60 mL作為培養(yǎng)基貯槽，高壓滅菌后備用，滅菌后將其平鋪在滅菌的克氏瓶培養(yǎng)液表面，然后將根霉菌點接種在透析膜上，共接5個點（平均分布），塞上棉塞，此時營養(yǎng)物質以擴散方式滲透通過透析膜供微生物生長需要。

3.3 培養(yǎng)

置32 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)36 h，菌絲布滿整個透析膜，培養(yǎng)結束。

3.4 菌絲收率的檢測

取一塊濾紙稱重，記錄原始重量（a），收集刮下附在透析膜上的菌絲體，放在濾紙上，稱重，記錄此時重量值（b），然后置在80 ℃的干燥箱中烘干至恒重，記錄此時的重量值（c）菌體濕重=重量b-重量a，菌體干重=重量c-重量a。

4 結果

培養(yǎng)8 h后可見在原接種點上有微小菌絲長出，之后逐漸長大，菌絲呈放射狀沿膜表面伸展蔓延，菌落呈白色，至28 h后，原5個接種點長成的菌落彼此被聯(lián)在一起，形成較厚的膜層，此時根霉生長處恒定期，生物量達最大，可以收獲。菌絲經洗刮，稱重，干燥處理，可得50 mL培養(yǎng)液菌體濕重10 g，干重2 g。

5 應用

5.1 直接用于釀酒

將菌絲體搗碎，以0.1%的接種量，拌入蒸熟的米飯中，32 ℃發(fā)酵培養(yǎng)，36 h后釀物成熟，釀成的甜酒釀口感鮮甜，露汁清亮，糖度均可達34°～36°。

5.2 作為種子使用，用于制曲

菌絲體搗碎兌水拌入滅菌的米粉中，按制曲工藝流程，制成的塊曲、散曲產品質量都可達到和超過傳統(tǒng)工藝方法制成的曲。

5.3 制成純根霉制品

菌絲體加入填充料直接干燥脫水制成純根霉菌體，塑料袋包裝，在常溫下貯藏半年，經檢驗根霉菌活力仍能保持原樣，并未有減退。

6 討論

6.1 透析膜的作用與選擇

透析膜除可作為隔開相鄰兩相，以及調節(jié)營養(yǎng)物質的轉移輸送之外，也是根霉菌絲體賴依在固體基質上生長沿伸的支撐基料，是一種固體基質，膜的選擇應考慮不被微生物分解和能耐蒸汽滅菌，因此膜應有一定的強度并且廉價易得。

6.2 麥芽培養(yǎng)基濃度的影響與作用

依據根霉的培養(yǎng)特性，有些根霉在老熟后會產生濃密的黑孢子，這對釀酒會產生負面的觀感，因此應盡量選用產黑孢子少的菌種[4]。試驗中發(fā)現(xiàn)提高麥芽汁培養(yǎng)基的濃度，可以防止根霉黑孢子的產生，這點可以在生產中推廣、應用。

6.3 透析膜培養(yǎng)技術的作用與應用前景

提高原料收率是制曲追求的目標，即單位重量的原料應能盡可能產生收獲更多的菌絲體生物量，比較各種制曲培養(yǎng)方法認為運用透析膜培養(yǎng)技術可以增加提高菌體的密度，最終可提高特定產物的再生產率。目前膜技術培養(yǎng)已首先在動物細胞生產干擾素，單克隆抗體等方面獲得了應用，根霉的透析膜培養(yǎng)技術經過縝密的試驗后，如能在實踐中加以推廣應用，這將徹底打破我國酒藥生產，藥拌草藥，以及定時定節(jié)，固體傳統(tǒng)培養(yǎng)作坊式生產的模式。