肝素類制品研究概述

趙梅，朱傳利，文良柱，梅麗，盧敏，陳剛

（江蘇萬邦醫(yī)藥科技有限公司，江蘇徐州 221004）

肝素是一種高度硫酸化的糖胺聚糖類化合物，由相同的二糖重復單元通過1,4-糖苷鍵連接構成，具有強力的抗凝作用，廣泛存在于哺乳動物的組織中，如肝臟、肺臟、心臟、腎臟、胎盤、腸黏液和血液中[1]。20世紀30年代，肝素開始用于臨床，現(xiàn)在已成為預防和治療靜脈血栓栓塞的主要藥物，是應用最廣泛的抗凝血藥物[2]。2015年，全球肝素市場達到125.8億美元。

1 普通肝素

普通肝素（Unfractionated heparin，UFH）分子量在3～30kDa，平均分子量為14kDa，主要從牛肺、豬腸黏膜等動物組織器官提取獲得，石欣[3]采用豬小腸，通過鹽解、離子交換、洗滌、洗脫，沉淀，脫水、干燥制備得肝素鈉粗品。臧盛等[4]利用酶解法以豬肺為原料提取出肝素鈉粗品。肝素與凝血因子的結合位點較多，可干擾凝血過程的多個環(huán)節(jié)，出血和血小板減少發(fā)生率較高。但其在血液保存、心臟手術、腎透析、抗動脈血栓等傳統(tǒng)抗凝血臨床應用上仍難以替代。

2 低分子量肝素

低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）分子量為3～8kDa，平均分子量為6kDa，其與抗凝血酶Ⅲ結合，通過抑制Xa凝血因子的活性而有效抑制血栓形成，對其他凝血因子影響小。研究結果顯示,相對于普通肝素,低分子量肝素生物利用度高，副作用小，引起出血和血小板減少的發(fā)生率更低，抗血栓作用強，半衰期更長，是治療急性靜脈血栓和急性冠脈綜合癥（心絞痛、心肌梗塞等）等疾病的首選藥物[5]。目前，低分子量肝素制品已在國內(nèi)市場占據(jù)主導地位。低分子量肝素的目前制備方法主要包括化學降解法、酶解法。

2.1 亞硝酸降解法

亞硝酸降解法是化學降解法制備肝素中最常用的一種制備方法，其以肝素鈉為起始原料，在一定的pH條件下，加入一定量的亞硝酸鈉解聚肝素鈉，生成低分子量肝素鈉[6]。目前已上市產(chǎn)品中達肝素、那屈肝素、舍托肝素都為亞硝酸降解法制得。亞硝酸降解法制備肝素，反應條件溫和，成本低，產(chǎn)率高，但其制得的產(chǎn)品分子量偏高。

2.2 β-消除降解法

β-消除降解法是以肝素鈉為原料，經(jīng)成鹽、成酯、解聚和純化得到肝素鈉片段。目前已上市的藥品中依諾肝素鈉使用β用消除降解法制得。依諾肝素鈉于1993年在美國批準上市，用于預防靜脈血栓栓塞性疾病。依諾肝素鈉注射液2017年銷售值15.75億歐元。銷售額居肝素類藥物首位，是全球最暢銷的抗血栓、抗凝血藥物之一。依諾肝素鈉是通過源自豬腸黏膜的肝素芐基酯的堿解聚而獲得，其平均分子量約為4.5kDa，使用100mg/mL制劑進行藥代動力學試驗，皮下注射后3～5 h出現(xiàn)最大抗Xa因子和抗Ⅱa因子活性，平均生物利用度在健康受試者中約為100%[7]。

2.3 酶解法

肝素酶是一類作用于肝素或者硫酸乙酰肝素分子的多糖裂解酶，可特異性裂解肝素大分子中的糖苷鍵，廣泛應用于肝素寡糖及低分子量肝素制備和肝素類分子的結構測定。已上市產(chǎn)品中亭扎肝素（商品名Innohep）使用肝素酶裂解制備。亭扎肝素1991年在歐洲上市，2000年在美國批準上市。亭扎肝素的平均分子量5.5～7.5kDa，抗FXa/抗FIIa活性為1.9～2.8。給藥后主要從腎臟排泄，平均清除率1.7L/h，消除半衰期3～4h。較長的半衰期減少了每天的用量[8]。

3 超低分子量肝素

超低分子量肝素（Ultra-low molecular weight heparin，ULMWH），分子量為1.5～3kDa，與低分子量肝素相比較，分子量的分布區(qū)間更加集中，有更好的抗血栓活性，更低的出血風險，對血小板的影響更小。在多種轉移性或局部進展性實體瘤患者中預防性使用超低分子量肝素后，靜脈血栓栓塞事件的發(fā)生率大幅降低。目前，對超低分子肝素的研究與開發(fā)已成為當前肝素的研究熱點。邢新會等[9]使用麥芽糖結合蛋白-肝素酶Ⅰ融合蛋白降解肝素得到超低分子量肝素，但其反應條件苛刻，成本過高，雜質(zhì)過多難以純化。王秀云等[10]以β王消除降解法為基礎，通過降解、純化獲得超低分子量肝素，但其也存在著抗Xa因子效價過低，抗Ⅱa效價過高，樣品純度不夠，會有一定幾率導致出血的問題。而合成法合成的超低分子量肝素制品性質(zhì)穩(wěn)定均一，消除了天然提取可能引入的雜質(zhì)（如硫酸軟骨素）污染。合成法根據(jù)方法的不同可分為化學合成法和酶合成法[11]。

3.1 化學合成法

化學合成法是目前成功獲得合成超低分子量肝素的方法之一，已上市產(chǎn)品有磺達肝癸納（商品名ARIXTRA）。與其他低分子量肝素制品相比較，磺達肝癸納為具有確定結構的單一化合物，分子量為1728Da。它是目前最高效的高選擇性Xa因子抑制劑，用于術后患者治療靜脈血栓栓塞，給藥后2h達到血漿峰濃度，半衰期為17h，64%～77%經(jīng)腎臟以原形藥物排出。然而，磺達肝癸納合成步驟繁瑣，最初的合成工藝需70步以上的化學反應，合成路線長，產(chǎn)率低，合成難度大，生產(chǎn)成本高，且合成過程易產(chǎn)生化學污染從而限制了其更好的應用[11-12]。

3.2 酶法合成

Rosenberg等首先通過酶法合成硫酸乙酰肝素。目前，酶法合成制備肝素主要有兩種途徑：（1）以大腸桿菌K5發(fā)酵的肝素前體（Heparosan）為底物，經(jīng)化學和酶法修飾得到生物工程肝素。BKuberan等在體外條件下模擬了高爾基體內(nèi)硫酸乙酰肝素（heparan sulfate, HS）的合成，建立了酶法合成HS方法，通過大腸桿菌K5菌株制備HS前體，HS前體經(jīng)NaOH去乙酰化，在三甲基胺三氧化硫共聚物和碳酸鈉的作用下發(fā)生N硫酸化，之后在C5異構化酶、2-OST1、6-OST1、6-OST2a以及3-OST1的作用下反應得到抗凝血的硫酸乙酰肝素多糖[13]。（2）以二糖為起始底物經(jīng)糖基轉移酶以UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺（或UDP-N-三氟乙酰葡萄糖胺）為單糖供體逐個添加單糖得到多糖骨架，并經(jīng)化學和酶法修飾得到超低分子量肝素[11]。劉健等報道了體外酶法合成超低分子肝素的途徑，GlcUA在肝素前體合成酶2（pmHS2）的催化作用下從UDPGlcUA轉移到糖鏈上，N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）或N-三氟乙酰葡萄糖胺（GlcNTFA）在N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶的催化作用下從UDP-GlcNAc或UDP-GlcNTFA轉移到糖鏈上，這兩個反應交替進行，延伸合成肝素多糖骨架。C5異構化酶和2-OST、6-OST以及3-OST催化下進行硫磺基團修飾，合成肝素化合物[14]。徐永梅等通過酶法合成了與抗凝血酶相互作用并顯示出抗Xa活性的八糖，大鼠模型試驗顯示其比磺達肝癸納有更快的清除率，有望開發(fā)成為短效抗凝血藥物[15]。

然而，酶法合成肝素技術仍然面臨很多難點，例如，肝素修飾酶硫磺基供體3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate，PAPS）價格昂貴且易分解，酶法合成產(chǎn)量不高；肝素修飾酶的表達量低，很難大量獲得，這些因素限制了酶法合成肝素的規(guī)模化生產(chǎn)[11]。

4 結語

我國是全球最大的肝素類產(chǎn)品出口國，出口結構上，肝素粗品占比重最大，低分子量肝素增長較快，當前龐大的應用群體和肝素類藥物臨床應用的發(fā)展使市場需求不斷增長。2008年肝素鈉致死事件之后，歐美等國不斷提高肝素類藥品的質(zhì)量標準和監(jiān)管要求[16]。而目前藥用肝素主要來源于豬小腸提取物，最終產(chǎn)品分子量分布范圍廣，在生產(chǎn)過程中不但受到小腸來源與質(zhì)量的制約，產(chǎn)品還存在著易受動物源性病原體，如病毒、朊病毒等污染的風險。合成法合成肝素，避免了動物源肝素生產(chǎn)過程中可能引入的雜質(zhì)，可以獲得性質(zhì)穩(wěn)定均一的藥物級純度的肝素替代傳統(tǒng)動物源肝素，很有開發(fā)前途。