不結球白菜種質創新及資源信息管理研究進展

潘靜嫻, 宋韻瓊, 崔麗潔*

(1.上海師范大學 生命科學學院 植物種質資源開發協同創新中心,上海200234;2.上海市閔行區農業技術服務中心,上海 201109)

不結球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino)屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種,包括普通白菜、烏塌菜、菜薹、薹菜、分蘗菜和白菜型油菜6個變種[1],前5個變種為菜用種質,白菜型油菜為油用種質.不結球白菜在南方稱為青菜或菘,北方稱作油菜,是我國特有的、深受消費者喜愛的重要綠葉類蔬菜,有明顯的雜種優勢.在長江中下游各城市,它的年均消費量都占到全年蔬菜消費總量的30%～40%,僅上海全年播種面積就達1×104hm2[2].此外,北方也大量引種,而且近年來,已逐漸成為了世界性的蔬菜[3].無論是在生產還是研究領域,不結球白菜都受到了廣泛關注,已在基因克隆、遺傳圖譜、DNA分子標記輔助育種、抗性育種等種質創新以及資源管理方面取得了很多進展[3-7].本文就不結球白菜在種質創新中的成果、研究進展、研究動態以及存在的問題進行了總結和綜述,以期為不結球白菜種質創新和科研方向的選擇提供一些參考和建議.

1 不結球白菜種質資源創新研究

1.1 耐熱抗病蟲和晚抽薹育種

不結球白菜是喜冷涼的兩年生蔬菜,食用部位為營養體,但市場需求要求實現周年生產.因此,快速生長、耐熱抗寒、耐抽薹、抗病蟲害是種質創新的主要目標.耐熱不結球白菜在南方地區夏季栽培蔬菜中占有重要地位.該地區夏季高溫多雨時間長達3～4個月,極端高溫可達40 ℃,因此耐熱抗暑濕育種就成為重要的育種目標.通過誘變形成多倍體是獲得抗性材料的重要方式[8],早在2002年,王亦菲等[9]用Co-γ射線照射不結球白菜小葉青干種子,經芽選獲得了耐熱突變體.而鄧云等[10],徐麗娟等[11],韓業飛等[12]則是采用秋水仙堿分別誘導上海青、不結球白菜依伶和六合矮腳黃,也獲得了耐熱性好的同源四倍體材料.受多基因控制的耐熱性狀目前更多采用雜交育種方式得到,如江蘇農科院培育的“東方2號”和“ 熱矮001”,南京理想農業科技有限公司的“烤青”和“ 青伏令”,南京農業大學的“熱火1號”和“熱火2號”,南京綠領種業有限公司的“綠領1407”,上海市閔行區農業技術服務中心的“閔青101”[13],日本武藏野種苗園株式會社的“華王”“ 夏王”“ 華冠”和“金夏蒔”等.此外,利用不結球白菜和耐熱大白菜雜交選育抗熱的不結球白菜也是一種新方法[4].

耐抽薹性是不結球白菜,尤其是普通白菜和塌菜兩個變種的重要農藝性狀.除制種外,抽薹越晚,生產性越好,食用價值也越高.利用雜交優勢是選育晚抽薹品種的主要方法,如“京綠7號”是上海地方品種“五月慢”和北京地方品種“四月慢”的雜交后代[14],其農藝性狀顯著優于主栽品種“四月慢”和“五月慢”.此外,不少晚抽薹雜交品種相繼育成,如江蘇農科院培育的“青優”和“ 春佳”,北京京研益農科技有限公司的“春油1號”和“春油2號”等.它們在生長過程中,始終不抽薹[15].今后,繼續選育適合冬春季栽培的晚抽薹品種仍是種質創新研究的方向之一.

春末到初秋的病蟲害是不結球白菜生產中的主要難點.尤其是各種蟲害,如菜青蟲、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、黃曲條跳甲、小菜蛾和蚜蟲等,如果不使用農藥,將導致幼苗無法存活,成株失去商品價值.而農藥的使用會帶來食品安全問題,因此培育抗病蟲,尤其是抗蟲的不結球白菜,是育種研究的重要方向和難點.在抗蕪菁花葉病毒(TuMV)問題上,南京農業大學早期利用系譜和母系選擇相結合的方法,育成了“矮抗I號”,后來利用雜交育種選育了“矮抗”IV～VI.針對十字花科根腫病這個世界性病害,目前主要是對根腫病基因分子標記[5]、抗性生理及鑒定[16-17]和抗性誘導[18]的研究,抗性育種并不多見.抗蟲育種雖然也有一些品種面世,如上海不結球白菜的主栽品種,由閘北區彭浦鄉農科站選育的“上海605”,以及上海農科院選育的“新夏青”和“矮抗青”等,但采用常規種質創新技術的進展總體不大,許多研究者轉而尋找轉基因手段.

1.2 胞質雄性不育體系的研究

國外關于不結球白菜細胞質雄性不育雜交種選育的報道很少[19],國內的相關報道主要有隱性核不育兩用系[20]、蘿卜質不育系[21]、波里馬油菜胞質不育系[22]和自交不親和系[19]等,其中自交不親和系是蕓薹屬中運用較廣泛的雜交制種途徑.由于不結球白菜屬于常異花授粉作物,一般自交結實正常,因此在不結球白菜中很難獲得優良的自交不親和系,而要通過蕾期剝蕾授粉才能獲得自交不親和系,制種成本很高.因而,借助胞質雄性不育特性的種間轉移就成為低成本利用雜交優勢育種的重要途徑,且目前取得了一定成果.莊靜等[23]于1989年,在甘藍型油菜中的細胞質雄性不育系中,通過種間雜交和回交,將不育性轉入到普通白菜中,育成了普通白菜雄性不育系.后經配制雜交組合,育成了雜交新組合“8008”,品種審定名為“滬青雜1號”.它是第一個利用普通白菜胞質雄性不育系選育的雜交種.陳龍正等[24]利用1份胞質雄性不育的“蘇州青”,轉入到江蘇農科院核心材料“90”中,也獲得了不育系“90-2”,并進行了分子鑒定.沈火林等[25]將甘藍型油菜中的胞質雄性不育特性轉育到11個不結球白菜品種中,獲得了3份異源胞質雄性不育系和其保持系,不育率達到了100%.另外,用秋水仙堿誘導二倍體后,再與不育四倍體雜交創建四倍體不結球白菜雄性不育材料,再轉育也是獲得不育品種的方法,如不育系“署1”[26],不育率達95%以上.更多不結球白菜不育材料的出現為不結球白菜雜種優勢的利用提供了便捷的途徑.

胞質雄性不育有一定的生長缺陷,如苗期低溫黃化[27]、花器形態不正常[24]等,因此,通過進行不同水平的鑒定,篩選得到生長健壯、高不育性的不育系和保持系十分必要,前人也做了不少工作.鄧曉輝等[28]對不結球白菜Polima胞質雄性不育系及其保持系的DNA基因組進行了random amplified polymorphism DNA (RAPD)分析,研究了兩系間的遺傳多樣性,并在不育系中獲得了一條穩定的sequence-characterized amplified region(SCAR)標記.周國林等[6]通過檢索美國國家生物技術信息中心(NCBI)核苷酸數據庫,獲得orf138和orf224開放閱讀框序列,設計了兩對引物,對小白菜和菜薹胞質雄性不育系和保持系進行了聚合酶鏈反應 (PCR)擴增,鑒定了該雄性不育為甘藍型油菜不育類型.朱紅芳等[29]利用葉綠素熒光技術,研究了不結球白菜雄性不育系和保持系不同時期的熒光參數,證實了不育系和保持系的植物學性狀僅在生殖生長期存在差異.

1.3 特異性基因克隆和轉基因抗性育種

1.3.1 特異性基因分離、克隆和表達分析

尋找和鑒定功能性基因,并進行基因克隆和遺傳改良是分子育種的核心.國內不少研究者在這方面做了大量工作,克隆了不少基因,并對這些基因的功能進行了深度挖掘.在抗病基因方面,陳曉峰等[30]利用 rapid-amplification of cDNA ends(RACE)技術,克隆了不結球白菜防衛素基因BcDF1.2的全長序列,經序列分析,證實了其與其他植物的防衛素基因和抗真菌基因有較高同源性.從被蕪菁花葉病毒感染的不結球白菜葉片中分離和克隆的BcLRK01基因,在TuMV和高鹽脅迫下,具有高表達特性[31].而從核盤菌感染的不結球白菜葉片中克隆的BcMPK4基因,在葉片中表達并參與了寄主對核盤菌的抗性[32].其后,更多抗病基因從不結球白菜中得到分離和克隆,功能也得到相應驗證.耐熱基因的挖掘也是不結球白菜特異性基因研究的重要內容.目前,研究者通過分離和克隆得到了不少與耐熱的相關基因,如熱激蛋白基因HSP家族中最保守的成員HSP70-1,已被從“抗熱蘇州青”中分離出來[33];而從3個耐熱品種“高華青”、“ 蘇州青”和“矮腳黃”中克隆得到了參與熱應答的磷脂酶D(PLD)基因[34].除了抗性基因,其他特異性基因,如硝酸還原酶基因[35]、抗壞血酸基因[36]、鋅指類超家族基因[37]、花色苷合成負調控基因[38]、花粉粒發育外殼蛋白基因[39],以及晚抽薹基因[40]等,也從不結球白菜中不斷得到分離和克隆,并進行了基因特征的初步分析.綜上所述,從不結球白菜中獲得的特異性基因類型多樣,包含抗病、耐熱、品質等基因,但未見從不結球白菜中分離和克隆出抗蟲基因的報道.

1.3.2 轉基因抗性育種

不結球白菜生產中的病蟲害,尤其是蟲害一直是困擾生產的一個難題.生產中主要依賴農藥來防治蟲害,但也給食品安全帶來很大風險,因此,研發抗病蟲的不結球白菜種質是解決安全問題的根本途徑.但從傳統的抗性育種來看,并沒有分離和克隆出自身抗蟲的基因,因此,進行分子水平育種,如轉基因育種就成為不結球白菜抗病蟲種質創新的關注焦點.

多年來,利用基因工程技術進行不結球白菜定向改良取得了一定成就.轉入的外源抗性基因主要有植物凝集素基因[41]、蛋白酶抑制劑基因[42-44]、芪合酶基因[45]、磷霉素和蛋白酶基因[46]和Bt基因[47-48],采用的方法有真空滲入、基因槍等,獲得了普通白菜、菜薹等的轉基因植株[49-50],也對轉基因材料進行了鑒定[44,47,51].王忠華等[47]對Bt轉基因抗蟲青菜株系T2、T4的分析表明,雖然轉基因株系的種子遠小于原種“上海青”,后期生長又明顯變慢,但具有發芽快和苗期生長快的優勢,可見Bt基因的插入對萌芽和苗期性狀相關基因的表達有較大影響.秦新民等[48]將CryIB基因轉入白雪小白菜中,獲得了轉Bt基因小白菜,CryIB基因得到了表達.鄧智年等[41]利用根癌農桿菌介導法,將豇豆蛋白酶抑制劑基因CPT1轉入中腳黑葉和矮腳黑葉中,獲得了轉CPT1的中腳黑葉和矮腳黑葉小白菜,經分子鑒定,CPT1基因已整合到小白菜中,小菜蛾飼喂鑒定顯示轉化植株具有一定的抗蟲性.盡管在20年前就育成了一些來自遠源物種抗性基因的不結球白菜轉化植株,對蟲害和病害也有一定抗性,但始終還是停留在實驗室和田間鑒定階段,并沒有進行安全性評價和生產.

1.4 遺傳圖譜和DNA分子標記輔助育種

農藝性狀的選擇是種質創新的基礎,但大多數農藝性狀是數量性狀,它們不僅受多基因控制,而且還受環境影響[7].因此,通過表型來選擇優良數量性狀的傳統育種方法存在很大不確定性.而分子標記輔助育種(MAS)將這些集中在一條染色體或幾條染色體的某一段的多基因用DNA分子標記出來,并確定與之連鎖的數量性狀在染色體上的位置,再標記到遺傳連鎖圖譜上,不需要等待花期或某一特定生長期來進行優良植株選擇,從而為實現育種早期定向改良種質提供了途徑.

目前已針對許多農作物構建了以分子標記為基礎的遺傳圖譜,通過建立分子遺傳圖譜,可同時對許多重要農藝性狀基因進行標記.在不結球白菜遺傳圖譜構建中,選擇不結球白菜的作圖群體是關鍵,關系到作圖效率和時間長短.主要利用雙單倍體(DH)群體和F2群體為作圖群體[52-53],再將分子標記與連鎖群以及遺傳圖譜匹配.目前,在不結球白菜遺傳圖譜的構建上已獲得了不少成果,如GENG等[54]利用112個DH群體構建了不結球白菜遺傳圖譜,圖譜覆蓋長度為1923.75 cM,包含了14條連鎖群和138個多態性分子標記.CHEN等[55]利用來自雜交小白菜“含笑”的127個DH作圖群體構建了不結球白菜的遺傳圖譜,圖譜覆蓋長度973.38 cM,含10條連鎖群和614個多態性分子標記.RAHUL等[56]利用了48個F2群體構建的不結球白菜遺傳圖譜,覆蓋長度354.6 cM,包含9條連鎖群和53個simple sequence repeats(SSR)標記.另外,采用 restriction fragment length polymorphism(RFLP)技術和改良的SSR標記技術來構建連鎖群,并與模式植物擬南芥或者其他近緣種的遺傳圖譜進行比較,也是輔助不結球白菜遺傳圖譜構建的重要手段[52-53].

在構建遺傳圖譜的同時,利用分子標記輔助育種選擇的親本以及育成的品種也不斷出現,從而為不結球白菜抗性雜交育種如抗病、抗蟲、晚抽薹等創建了優良的自交不親和系,也為大田生產提供了優質的品種資源.如GENG等[54]所用的DH作圖群體“暑綠”,其母本是用分子標記技術從“矮腳黃”中選擇的自交不親和系.CHEN等[55]的研究材料雜交小白菜品種“含笑”,其母本“SW-13”是通過分子標記技術從“矮腳黃”中選擇的自交不親和系.RAHUL等[56]的F2作圖群體,親本“Barharl mandi”就是利用分子標記從“喜馬拉雅”中篩選的.因此,隨著對不結球白菜亞種的更多變種遺傳圖譜的構建,分子標記輔助育種將創建更多的新種質和自交不親和系.

2 不結球白菜種質資源信息管理

獲得優良育種材料是種質創新的基礎和前提.在不結球白菜5個菜用變種中,普通白菜、烏塌菜、菜薹、薹菜4個變種,尤其是普通白菜均有數量龐大的品種.而且市場上同名異種或異名同種的品種普遍存在,品種資源較為混亂,此外,種質資源大多分散在全國各地的不同單位,或育種者,或生產者手中,要從中獲得需要的種質資源或育種材料是比較困難的.因此有必要建立一個數據庫管理系統,將不結球白菜種質資源進行信息化管理,通過互聯網實現數據共享,而管理者也適時進行系統更新,就可以為育種工作者、生產者及其他專業人員提供一個不結球白菜的大數據平臺,有利于不結球白菜種質資源的創新和利用.

不結球白菜種類繁多,資源的收集是建立數據庫的基礎,各國都在致力于遺傳資源的收集與保護.中國是不結球白菜的原產國,在遺傳種質保護上更具有重大的責任.王克娟等[57]對江蘇省的不結球白菜種質進行了收集和整理,截止到1995年,全省的種質有196份,包括了不結球白菜菜用的5個變種.袁華玲等[58]在安徽省收集的116份不結球白菜種質,只有普通白菜和塌菜2個變種.侯喜林等[3]在20世紀80年代收集了白菜類地方種質200多份,并記錄了26個農藝性狀.宋韻瓊等[59]在全國范圍內收集了普通白菜品種資源600種,并進行了種質鑒定和數據庫的創建.而建于1986年的中國國家種質庫截止到2015年收集的不結球白菜種質已達到1392個,占總種質數據庫資源的4.25%,其中有1215個進入了國家種質中期庫[60].針對不結球白菜中優良品種的保護也取得了一定成果,如蘇州市蔬菜研究所收集的各種“蘇州青”就有80多份[61].隨著種質的不斷創新以及地方種質的不斷出現,對不結球白菜種質的收集和鑒定將持續開展,種質的遺傳信息如遺傳圖譜等的收錄將是未來種質信息采集的新方向.

借助于網絡技術將收集鑒定的種質資源進行網絡化管理是現代種質資源管理的發展趨勢.目前,建立數據庫的種質主要是普通白菜、烏塌菜和菜薹3個變種,其數據庫或是變種的獨立數據庫,或是含在蔬菜數據庫中的一個子數據庫,如普通白菜數據庫就只有一個變種的品種資源,屬獨立數據庫[59],而在中國作物種質信息網(CGRIS)、美國種質中心網絡系統(GRIN)等大型數據庫中,不結球白菜只是園藝作物子數據庫的子數據庫[62].除種質資源信息庫外,也建立了一些不結球白菜的專題數據庫,如病蟲害數據庫,LIU等[63]建立的白菜類蔬菜的害蟲綜合管理系統(IPM),就是一個包含白菜類蔬菜害蟲發生特點到綜合防治獨立模塊的主題數據庫.將來有可能建立一個包含不結球白菜所有種質的數據庫,并實現真正的全網共享,為種質創新、生產和科研教學提供一個快捷的資源信息平臺.

3 結 語

不結球白菜是中國特有的蔬菜種質資源,不少種類已成為世界性的蔬菜,受到廣大消費者的喜愛.中國在不結球白菜種質創新如細胞質雄性不育、分子標記育種以及抗病、晚抽薹育種等方面的研究取得了顯著的成果,育成的一些種質在生產中成了主栽品種,但與一些進口種質如“日本花王”“夏王”“華冠”等青梗菜相比,在抗病蟲、耐暑濕、生長整齊度、食用性方面還是存在一定差距.不結球白菜育種資源主要針對普通白菜、塌菜和薹菜,而在薹菜和分蘗菜上的利用相對較少.研究不結球白菜種質創新的單位主要集中在國內,尤其是南京農業大學和上海農科院在不結球白菜種質基因克隆和測序、分子標記輔助技術等方面的工作遙遙領先[3,23,29-30],并利用細胞質雄性不育和DNA分子標記輔助技術育成了不少新種質,有些已成為生產中的常規栽培品種.抗蟲育種仍然是抗性育種中的難點,至今還沒有重大突破,未來的育種應該以抗蟲為主攻方向,有效解決不結球白菜從春到秋高溫季節蟲害嚴重的問題,實現減農藥的不結球白菜生產目標.對豐富的不結球白菜種質資源的收集整理、鑒定和信息化管理應該加強,廣泛收集農家品種資源,挖掘優良農藝性狀,尤其是抗蟲特性,最終建立一個全球范圍內共享的不結球白菜種質數據庫.