IL-32α抑制胰腺癌細胞上皮間質轉化和侵襲轉移作用機制研究

李冰震　王理富　吳文元　陳景鋒

IL-32是一種促炎細胞因子，包含6種主要的亞型（IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε、IL-32ζ），其中最主要的為IL-32α[1-2]。研究發現，不同亞型的IL-32在炎癥性腸病、腫瘤、自身免疫病等中扮演不同的角色，在細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長、增強炎癥反應以及促進血管生成等過程中發揮不同的生理作用[3-5]。胰腺上皮細胞的上皮間質轉化（EMT）與胰腺腫瘤的侵襲轉移密切相關，其中鈣黏附蛋白E（E-cadherin）的表達下調以及某些間質細胞標志物[如波形蛋白（Vimentin）、E盒結合鋅指蛋白1（Zeb1）]表達上調被認為是EMT過程的標志[6-7]；金屬基質蛋白酶（MMPs）可降解細胞基膜和外基質，與金屬基質蛋白酶抑制物（TIMPs）保持動態平衡，在胰腺癌的侵襲轉移中同樣起重要作用[8]。Janus激酶（Jak）及其下游通路蛋白細胞信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）可調節功能基因的轉錄，調控細胞凋亡、侵襲和轉移等；Jak/STAT3信號通路參與調控胰腺癌EMT過程[9-10]。基于此，本研究將不同濃度的IL-32α作用于人胰腺癌細胞Panc-1、AsPC-1，檢測胰腺癌細胞的EMT、侵襲轉移及Jak2/STAT3信號通路的改變，探討其作用機制，現報道如下。

1　材料和方法

1.1材料人胰腺癌細胞株Panc-1、AsPC-1購自上海生命科學研究所；重組人IL-32α購自北京義翹神州生物技術有限公司；STAT3、p-STAT3、Jak2、p-Jak2、E-cadherin、Vimentin、Zeb1、MMP-2、MMP-9、GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology公司；Trizol細胞裂解液購自美國Invitrogen公司；cDNA逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；SYBR green RT-PCR反應試劑盒購自美國Thermo公司；蛋白濃度試劑盒購自廣州白云天公司；7500熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；熒光顯微鏡（DM4000M）購自德國徠卡公司；自動曝光機（Image QuantTM400）購自德國Rawak Software公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組將Panc-1細胞株培養于含10%FBS的DMEM培養基中；人胰腺癌細胞AsPC-1細胞株培養于含10%FBS的1640培養基中；兩者均置于37℃、5%二氧化碳的細胞培養箱中常規培養傳代。在Panc-1及AsPC-1細胞株中分別添加不同濃度的IL-32α后分為0μg/ml組（空白對照組）、10μg/ml組、25μg/ml組、50μg/ml組。

1.2.2RT-PCR檢測Vimentin、CDH1、Zeb1、MMP-2及MMP-9的mRNA表達水平采用Trizol細胞裂解液提取上述4組Panc-1、AsPC-1細胞總RNA；分光光度計檢測所提取RNA的純度及濃度；cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，SYBR green RT-PCR反應試劑盒與不同的引物（引物序列詳見表1）在7500熒光定量PCR儀中進行目標片段擴增；反應程序為（95°C 10min）×1個循環（95°C 15s）×40個循環（62°C 60s）×40個循環。實驗重復3次，取平均值。

表1　引物序列

1.2.3Western blot檢測E-cadherin、Vimention、Zeb1、MMP-2、MMP-9蛋白及Jak2/STAT3信號通路蛋白p-Jak2、Jak2、p-STAT3、STAT3表達水平用含有PMSF和磷酸酶抑制劑的RAPI裂解液（裂解液：PMSF：磷酸酶抑制劑=1 000∶10∶100）充分裂解上述4組Panc-1和AsPC-1細胞，提取總蛋白；并檢測濃度；根據不同的蛋白濃度配比不同量PBS，加入4μl 5×SDS上樣緩沖液配制成濃度相同總量為20μl的上樣液；變性（100°C 5min）后加在5%濃縮膠及不同濃度的分離膠（8%～12%）中電泳，先以55V恒壓進行，至濃縮膠和分離膠交界線處（通常至Marker條帶顯現）轉換電壓為110V。恒流轉膜，電流為350mA，時間根據每個目的蛋白的分子量不同而異。將轉有蛋白的PVDF膜放入5ml 5%脫脂奶粉液中封閉1～2h，棄去封閉液，1×TBST洗膜（3次，5min/次）；將膜置于載玻片上，用一抗4°C下孵育過夜，1×TBST液洗膜（3次，5min/次），再置于二抗液（1∶5 000）中室溫搖床低速孵育1～2h，棄去二抗液，1×TBST液洗膜（3次，5 min/次）。用image lab自動曝光機檢測相應的蛋白質條帶，分析條帶灰度值。實驗重復3次，取平均值。

1.2.4細胞免疫熒光技術檢測Vimentin蛋白表達將無菌黏附蓋玻片置于6孔板中，每張玻片上滴25ug/ml的多聚賴氨酸1ml，室溫下過夜。取上述4組對數生長期細胞，并將細胞懸液種植在黏附蓋玻片上，培養基培養6～8h，待細胞貼壁且生長至70%～80%后，棄去原培養液，分別加入含不同濃度IL-32α的無血清培養液培養24h。棄去培養液洗滌后每孔加4%多聚甲醛1ml，室溫固定10min后棄去，PBS清洗。加入0.3%Triton-100 1ml，室溫孵育10min后棄去，PBS清洗。加入適量5%山羊血清室溫封閉30min后棄去，將蓋玻片覆蓋于一抗液上，置于一抗孵育濕盒內4℃過夜，次日將蓋玻片重新置于6孔板中，PBS清洗；避光二抗孵育(37℃60min)，PBS清洗；每孔滴加5μg/ml DAPI 1滴并將黏附蓋玻片蓋上，細胞核染色（37℃3min），PBS清洗；每孔滴加1滴抗熒光淬滅封片。熒光顯微鏡觀察細胞形態，并選定位置分別拍細胞核和細胞質染色照。

1.3觀察指標觀察不同濃度IL-32α對胰腺癌細胞EMT、侵襲轉移、Jak2/STAT3信號通路蛋白的抑制結果。1.4統計學處理應用SPSS 19.0統計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1不同濃度IL-32α對胰腺癌細胞EMT的抑制結果見圖1。

圖1　不同濃度IL-32α對胰腺癌細胞EMT的抑制結果（a、b：Vimentin、CDH1、Zeb1 mRNA表達水平比較；c、d：E-cadherin、Vimentin、Zeb1蛋白表達水平比較，內參蛋白為GAPDH；e、f：Vimentin蛋白免疫熒光染色強度比較；與0μg/ml組比較，*P＜0.05；與10μg/ml組比較，#P＜0.05；與25μg/ml組比較，△P＜0.05）

由圖1 a、b可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞EMT相關分子標志物上皮樣標志物E-cadherin的mRNA CDH1表達水平均呈IL-32α劑量依賴性上調（均P＜0.05)，而細胞間質樣標志物Vimentin、Zeb1的mRNA表達水平均呈IL-32α劑量依賴性下調（均P＜0.05)。

由圖1 c、d可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞E-cadherin的蛋白表達水平均呈IL-32α劑量依賴性上調（均P＜0.05），而Valentin、Zeb1的蛋白表達水平均呈IL-32α劑量依賴性下調（均P＜0.05）。

由圖1 e、f可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞Vimentin蛋白表達于細胞質中，免疫熒光染色強度呈IL-32α劑量依賴性下調（均P＜0.05）。

2.2不同濃度IL-32α對胰腺癌細胞侵襲轉移的抑制結果見圖2。

圖2　不同濃度IL-32α對胰腺癌細胞侵襲轉移的抑制結果（a、b：MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平比較；c、d：MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較，內參蛋白為GAPDH；與0μg/ml組比較，*P＜0.05；10μg/ml組比較，#P＜0.05；與25μg/ml組比較，△P＜0.05）

由圖2a、b可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞中MMP2 mRNA均呈IL-32α劑量依賴性下調（均P＜0.05），胰腺癌AsPC-1細胞中MMP9 mRNA呈IL-32α劑量依賴性下調（均P＜0.05）。

由圖2c、d可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均呈IL-32α劑量依賴性下調（均P＜0.05）。

2.3不同濃度IL-32α對胰腺癌細胞Jak2/STAT3信號通路蛋白的抑制結果見圖3。

圖3　不同濃度IL-32α對胰腺癌細胞Jak2/STAT3信號通路蛋白的抑制結果（內參蛋白為GAPDH）

由圖3可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞中Jak2/STAT3信號通路蛋白p-Jak2、Jak2、p-STAT3的表達水平均呈IL-32α劑量依賴性下調（均P＜0.05），STAT3的表達水平不受IL-32α濃度的影響（P＞0.05）。

3　討論

胰腺癌的高度侵襲性通常被認為是患者預后極差的重要原因之一。EMT是腫瘤發生、發展過程中重要的生物學過程；它迫使最初的腫瘤細胞獲得侵襲轉移能力從而轉移至腫瘤邊緣，或者通過血液、淋巴液等其他媒介轉移至人體的其他部位形成新的腫瘤灶[11]。EMT與胰腺癌患者淋巴結的轉移、門靜脈的癌栓形成以及患者的長期生存率有顯著的相關性[12]。逆轉EMT正成為越來越重要的臨床治療胰腺癌的目標。本研究結果顯示，IL-32α不但可以從基因層面上促進轉錄因子CDH1，抑制轉錄因子Vimentin和Zeb1；還可從蛋白層面上促進E-cadherin蛋白的表達，抑制Vimentin和Zeb1蛋白的分泌。MMPs是一系列家族性肽鏈內切酶，在EMT過程中具有降解細胞基底膜的蛋白水解活性。MMPs在胰腺癌中已被證明具有增加細胞侵襲性，促進血管生成以及誘發藥物抗性等作用；有研究認為其在胰腺癌的侵襲轉移過程中是另一種重要的監控分子[13-14]。本研究結果顯示，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞分泌高水平的MMP-2和MMP-9；且RT-PCR結果顯示MMP-2、MMP-9的mR-NA可被IL-32α抑制，Western blot結果也顯示IL-32α可抑制MMP-2、MMP-9蛋白的分泌。但是，值得注意的一個現象是IL-32α抑制MMPs蛋白程度要遠大于抑制mRNA程度，這提示IL-32α抑制胰腺癌細胞MMPs蛋白的表達可能是通過抑制基因的轉錄后水平實現。綜上，筆者認為IL-32α可通過影響蛋白水解酶的激活以及黏附能力來部分抑制胰腺癌細胞的侵襲轉移能力。這些發現反映了IL-32α影響胰腺癌生物學屬性的潛在可能，當然，這需要進一步的體內外實驗論證。

關于IL-32對腫瘤細胞EMT及侵襲轉移的影響，許多學者持有不同的觀點。一些研究者認為異常分泌的IL-32β可通過調節VEGF-STAT3信號通路來刺激腫瘤細胞的遷移[3]。也有研究發現肺腺癌細胞中IL-32可通過激活NF-κB增強MMP-2、MMP-9的表達，這些觀點與本研究的結論有所矛盾[4]。筆者認為不同類型的腫瘤表達不同類型和數量的IL-32受體，這可以部分解釋不同亞型的IL-32對各種腫瘤細胞所造成的差異影響。這提示，不同濃度的IL-32α是影響腫瘤細胞相關的生物學性能的另一個因素。此外，Jak2/STAT3通路被認為在胰腺炎誘導的Kras-依賴的胰腺癌腫形成中占有重要的地位[15]。本研究結果顯示Jak2/STAT3信號通路可以被IL-32α抑制；這間接表明IL-32α類似AG490（Jak2的特異性抑制劑）具有潛在抑制胰腺癌細胞侵襲轉移的能力，甚至存在逆轉慢性胰腺炎誘導胰腺癌的可能。重要的是，本研究中還發現胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞都可自發的分泌高水平p-STAT3；雖然這并不是公認的典型與EMT相聯系的途徑，有研究證實STAT3通過相關機制改變轉錄因子Zeb1來影響腫瘤細胞的EMT[16]。本研究同樣發現胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞中Zeb1表達水平隨著p-STAT3的增多而顯著上升。因此，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞中自發分泌的高水平p-STAT3被IL-32α顯著抑制可以認為是其抑制胰腺癌EMT與侵襲轉移的一種重要機制；高水平的p-STAT3可能在維持EMT特性和胰腺癌細胞的侵襲性中發揮著重要作用。當然，不排除其他可能存在的IL-32α抑制胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞EMT及侵襲轉移的潛在機制。

綜上所述，胰腺癌具有高度侵襲性和低生存率的特性，本研究結果表明，IL-32α在一定劑量范圍內以劑量依賴性的方式抑制胰腺癌Panc-1、AsPC-1細胞EMT和侵襲轉移。IL-32α對于胰腺癌的精準治療有潛在的臨床運用前景。相比傳統化療藥物，IL-32α作為一種內源性細胞因子具有無免疫原性以及低細胞毒性等優勢，患者可在一定程度上減輕傳統化療藥物所引起的諸多不良反應；但這些生物學功能均需要進一步的體內外實驗研究。IL-32α及Jak2/STAT3信號通路或可作為潛在的藥理干預胰腺癌進展的分子靶點。

[1]Shoda H,Fujio K,Yamaguchi Y,et al．Interactions between IL-32 and tumor necrosis factor alpha contribute to the exacerbation of immune-inflammatory diseases[J]．Arthritis research&therapy,2006,8(6)：R166．

[2]Shioya M,Nishida A,Yagi Y,et al．Epithelial overexpression of interleukin-32alpha in inflammatory bowel disease[J]．Clinical and experimental immunology,2007,149(3)：480-486．

[3]Park JS,Choi SY,Lee JH,et al．Interleukin-32beta stimulates migration of MDA-MB-231 and MCF-7cells via the VEGF-STAT3 signaling pathway[J]．Cellular oncology,2013,36(6)：493-503．

[4]Zeng Q,Li S,Zhou Y,et al．Interleukin-32 contributes to invasion and metastasis of primary lung adenocarcinoma via NF-kappaB induced matrix metalloproteinases 2 and 9 expression[J]．Cytokine,2014,65(1)：24-32．

[5]Sorrentino C,Di Carlo E．Expression of IL-32 in human lung cancer is related to the histotype and metastatic phenotype[J]．American journal of respiratory and critical care medicine,2009,180(8)：769-779．

[6]Huang C,Yang G,Jiang T,et al．The effects and mechanisms of blockage of STAT3 signaling pathway on IL-6 inducing EMT in human pancreatic cancer cells in vitro[J]．Neoplasma,2011,58(5)：396-405．

[7]Shaul YD,Freinkman E,Comb WC,et al．Dihydropyrimidine accumulation is required for the epithelial-mesenchymal transition[J]．Cell,2014,158(5)：1094-109．

[8]Lukaszewicz M,Mroczko B,Szmitkowski M．[The role of metalloproteinasesandtheirinhibitorsinpancreaticcancer][J]．Postepy Higieny I Medycyny Doswiadczalnej,2008,62(1)：141．

[9]Yu H,Kortylewski M,Pardoll D．Crosstalk between cancer and immune cells：role of STAT3 in the tumour microenvironment[J]．Nature Reviews Immunology,2007,7(1)：41．

[10]Xiong H,Zhang ZG,Tian XQ,et al．Inhibition of JAK1,2/STAT3 Signaling Induces Apoptosis,Cell Cycle Arrest,and Reduces Tumor Cell Invasion in Colorectal Cancer Cells[J]．Neoplasia,2008,10(3)：287．

[11]Lim J,Thiery JP．Epithelial-mesenchymal transitions：insights from development[J]．Development,2012,139(19)：3471．

[12]Kohler I,Bronsert P,Timme S,et al．Detailed analysis of epithelial-mesenchymal transition and tumor budding identifies predictors of long-term survival in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]．Journal of Gastroenterology&Hepatology,2015,30(S1)：78-84．

[13]Gao L,Zheng M,Zhu Y,et al．Selection of Peptide Inhibitor to Matrix Metalloproteinase-2 Using Phage Display and Its Effects onPancreaticCancerCell lines PANC-1 and CFPAC-1[J]．International Journal of Biological Sciences,2012,8(5)：650．

[14]Haage A,Schneider IC．Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells[J]．Faseb Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology,2014,28(8)：3589-3599．

[15]Lesina M,Kurkowski MU,LUDES K,et al．Stat3/Socs3 activation by IL-6 transsignaling promotes progression of pancreatic intraepithelial neoplasia and development of pancreatic cancer[J]．Cancer cell,2011,19(4)：456-469．

[16]Guo L,Chen C,Shi M,et al．Stat3-coordinated Lin-28-let-7-HMGA2 and miR-200-ZEB1 circuits initiate and maintain oncostatin M-driven epithelial-mesenchymal transition[J]．Oncogene,2013,32(45)：5272-5282．