銀杏酚C17 1與順鉑聯用逆轉A549／DDP細胞對順鉑的耐藥性

董燕，李月英，張心馳，楊小明，厲琳杰，馬文斌

（江蘇大學1.醫學院，2.食品與生物工程學院，江蘇 鎮江212013）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌80%～85%［1］。目前，基于鉑類藥物的聯合化療方案是NSCLC標準的藥物治療方案之一，但其毒副作用大且易產生耐藥性，是治療失敗的重要原因［2］。研究表明，中藥因其毒副作用小，效價高，在臨床腫瘤輔助治療中發揮重要作用［3］。

核轉錄因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2）是一種抗氧化應激的核轉錄因子［4］，其激活后自Keap1蛋白解離進入胞核與抗氧化反應元件（ARE）結合，啟動下游靶基因多藥耐藥相關蛋白1（multidrug resistance associated protein 1，Mrp1）等表達，參與細胞耐藥性的調控［5－6］。Nrf2-ARE信號通路在癌癥中呈高表達，促進癌癥的發生發展，是誘發多種癌細胞耐藥產生的重要因素［7］。在肺癌和乳腺癌中，下調Nrf2可顯著增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［8］。因此，亟待尋找一種抑制Nrf2／Keap1信號通路的新型物質，來輔助治療化療耐藥的肺癌。

銀杏作為中國傳統藥物，已有上千年的治療歷史［9］。銀杏酚C17 1是銀杏外種皮提取物烷基酚類化合物中的銀杏酚單體之一，具有細胞毒性，但低劑量時細胞毒性較弱［10］。有研究揭示，與銀杏酚其他單體比較，銀杏酚C17 1抗腫瘤活性最高，可抑制肝癌HepG2細胞增殖、遷移和侵襲［11］。本課題組前期研究結果表明［12］，銀杏酚C17 1與順鉑聯用可促進肝癌細胞的凋亡，但其能否作為順鉑的輔助藥物增強化療敏感性尚不清楚。因此，本研究將銀杏酚C17 1與順鉑聯合作用，觀察A549／DDP耐藥細胞中Nrf2／Keap1信號通路及下游蛋白Mrp1表達的情況，探討銀杏酚C17 1與順鉑聯用對A549／DDP耐藥細胞的作用機制。

1　材料與方法

1.1　材料

人肺腺癌A549、A549／DDP細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院。純度98%銀杏酚C17 1（江蘇大學食品學院）；RPMI 1640（Wisent公司）；胎牛血清（Gibco公司）；順鉑、MTT試劑（Sigma公司）；Transwell小室（Corning公司）；流式細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC／PI（美國BD公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）；Mrp1、Keap1、Bcl2、Bax、β-肌動蛋白及組蛋白H3抗體（Cell Signaling Technology公司）；Nrf2蛋白抗體（Abcam公司）；HRP標記的兔二抗、鼠二抗（碧云天生物技術公司）；PVDF膜、ECL-plus發光劑（美國Millipore公司）。

1.2　方法

1.2.1細胞培養 A549、A549／DDP細胞株培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，并置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中孵育；在A549／DDP細胞培養基中加入1 mg／mL順鉑維持 A549／DDP細胞的耐藥性。細胞生長密度達90%時用胰酶消化傳代；取處于對數生長期的細胞，進行后續實驗。

1.2.2MTT法檢測細胞活性 收集 A549、A549／DDP細胞用RPMI 1640培養液稀釋成1×105／mL，接種于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育12 h。根據不同的實驗目的進行分組，在檢測順鉑對細胞活性的影響時，分為對照組（順鉑0 mg／L）和實驗組（順鉑 1，2，4，8，16 mg／L），分別作用于A549／DDP細胞24 h；在檢測銀杏酚與順鉑聯用對耐藥細胞活性的影響時，分為對照組［順鉑（0 mg／L）＋銀杏酚（0 mg／L）］和實驗組［不同濃度順鉑（1、2、4、8、16 mg／L）分別與不同濃度銀杏酚 C17 1（10、20、40mg／L）］，共同作用于A549／DDP細胞24 h；每孔加入10μLMTT溶液（5mg／mL），避光培養4 h；棄培養液，每孔加入100μL二甲基亞砜，徹底混合。使用酶標儀（美國Bio-Rad公司）在490 nm波長處測量光密度值（D）。每組實驗重復3次，設置5個復孔。細胞相對存活率＝（實驗組D均值－空白對照組D均值）／（實驗對照組D均值－空白對照組D均值）。

1.2.3Transwell實驗檢測 A549／DDP細胞遷移和侵襲能力

1.2.3.1細胞遷移實驗 取對數生長期 A549／DDP細胞，胰酶消化，用無血清RPMI 1640培養基懸浮細胞，調整細胞密度為2×105／mL。用無血清RPMI 1640培養基配置藥物，在下室（24孔板底部）加入500μL含10%血清的RPMI 1640培養液，上室加入300μL懸浮細胞以及相應的藥物（0 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑分別與 10、20、40 mg／L銀杏酚 C17 1聯用），于 37℃、5%CO2培養箱中培養24 h；4%低聚甲醛固定細胞30 min；吉姆薩染液染色20 min；蒸餾水清洗小室，用棉花將上室內的染液輕輕擦干，待晾干后于高倍鏡下（×200）觀察細胞，隨機選取10個視野計數（遷移細胞數）。每組實驗重復3次，計算細胞遷移率＝實驗組遷移細胞數／對照組遷移細胞數。

1.2.3.2細胞侵襲實驗 用4℃預冷的無血清RPMI 1640培養基稀釋基質膠至終濃度為1 mg／mL；取60μL加入小室上部，37℃溫育4～5 h使其干成膠狀；后續步驟同遷移實驗。

1.2.4免疫印跡法檢測Nrf2／Keap1信號通路相關蛋白的表達 將對數生長期A549／DDP細胞接種于6孔板，每孔約1×106個，每組設置3個復孔。培養過夜后，分別加入含 0 mg／mL，4 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑分別與10、20、40 mg／L銀杏酚 C17 1聯用的培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h；加入預熱的細胞裂解液（70μL）裂解細胞，提取總蛋白；100℃煮沸5min；超聲儀破碎10 s，離心30 s；提取的蛋白儲存于－20℃備用。

配置10%或12%聚丙烯酰胺凝膠，70 V電泳2 h；轉膜（PVDF膜）2 h；用含 5%牛奶的 TBST（80 g／L NaCl，2 g／L KCl，30 g／L Tris，0.1%Tween-20；pH＝7.4）封閉 1 h；加入一抗 Nrf2、Keap1、Mrp1、Bcl2、Bax抗體（1 1 000）及內參β-肌動蛋白和組蛋白H3抗體（1 1 000）4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；除內參 β-肌動蛋白為鼠二抗（1 1 000），其他蛋白均為兔二抗（1 1 000），孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15min；ECL發光劑曝光；Lane 1D凝膠分析軟件進行灰度掃描，得出灰度值。蛋白相對表達量＝目的蛋白灰度值／β-肌動蛋白灰度值，每組實驗重復3次。1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數期生長A549／DDP細胞，均勻接種于24孔板，每孔約3×104個，每組設3個復孔。過夜貼壁后加藥（0 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑，4mg／mL順鉑分別與 10、20、40 mg／L銀杏酚 C17 1聯用）培養 24 h；用0.25%無EDTA的胰酶消化細胞，蒸餾水洗3次，離心；取100μL過篩后的細胞（3×104個／mL）懸浮于流式管中，于冰上避光條件下依次加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕輕混勻；10 min后加入緩沖液400μL，設置一組單染的陽性對照，2 h內利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3　統計學分析

運用SPSS 22.0軟件分析數據，每組實驗重復3次，實驗結果以均數±標準差(±s）表示，多組比較行單因素方差分析，實驗組與對照組比較采用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。采用Origin法計算肺腺癌細胞增殖的半數抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）。

2　結果

2.1　順鉑對敏感A549細胞和耐藥細胞A549／DDP細胞活性的影響

MTT檢測結果如圖1所示，單獨順鉑作用，敏感A549細胞和耐藥A549／DDP細胞活性均不同程度地被抑制，但抑制A549／DDP細胞活性明顯需要更高濃度的順鉑；經計算得出 A549和 A549／DDP細胞的 IC50所需的順鉑濃度分別為（7.0±0.09）mg／L和（40.0±0.13）mg／L，A549／DDP細胞對順鉑的耐藥性是A549細胞的5.8倍，表明A549／DDP是順鉑耐藥細胞株。根據MTT的結果，本研究選取4 mg／L順鉑進行后續實驗。

圖1　不同濃度的順鉑對A549和A549／DDP細胞活性的影響

2.2　銀杏酚C17 1對A549／DDP耐藥細胞遷移的影響

與對照組比較，順鉑組耐藥細胞遷移率沒有顯著的變化（P＞0.05）；但與對照組及順鉑組相比，10，20，40 mg／L銀杏酚C17 1與順鉑聯用明顯抑制耐藥細胞的遷移能力（P＜0.05），且呈銀杏酚C17 1劑量依賴性。見圖2。結果表明，銀杏酚C17 1能增強順鉑對A549／DDP耐藥細胞遷移的抑制能力。

2.3　銀杏酚C17 1對A549／DDP耐藥細胞侵襲的影響

如圖3所示，與對照組相比，順鉑組細胞侵襲力稍有降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照組及順鉑組比較，銀杏酚與順鉑聯用時，隨著銀杏酚C17 1濃度（10，20，40 mg／L）的升高，細胞侵襲數量呈明顯下降趨勢（P＜0.05）。由此說明，銀杏酚C17 1能夠增強順鉑對A549／DDP耐藥細胞侵襲的抑制能力。

2.4　銀杏酚C17 1對A549／DDP細胞耐藥的逆轉作用

MTT法檢測結果如圖4所示，與對照組相比，銀杏酚 C17 1（10，20，40mg／L）與順鉑1mg／L聯用時，細胞存活率沒有明顯變化（P＞0.05）；同時，銀杏酚 C17 1（10，20 mg／L）與順鉑 2 mg／L聯合作用時，細胞活性較對照組也沒有明顯差異（P＞0.05）。其余各實驗組細胞活性與對照組相比差異均具有統計學意義（P＜0.05或 P＜0.01）。結果表明，銀杏酚C17 1劑量上調增強順鉑的細胞毒性，逆轉耐藥細胞對順鉑的耐藥性。

圖2　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯用對A549／DDP耐藥細胞遷移的影響（×200）

2.5　銀杏酚C17 1對A549／DDP耐藥細胞Nrf2／Keap1信號通路的影響

如圖5所示，與對照組和順鉑組相比，順鉑與不同濃度銀杏酚 C17 1（10，20，40 mg／L）聯合應用組總Nrf2與核內Nrf2表達明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），其結合蛋白 Keap1表達明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。

圖3　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯用對A549／DDP耐藥細胞侵襲的影響（×200）

圖4　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯用對A549／DDP耐藥細胞活性的影響

圖5　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯用對A549／DDP耐藥細胞Nrf2／Keap1信號通路相關蛋白表達的影響

同時下游Mrp1蛋白表達也明顯降低（P＜0.05）。由此表明，銀杏酚 C17 1可能通過抑制Nrf2／Keap1信號通路逆轉 A549／DDP細胞的耐藥性。

2.6　銀杏酚C17 1對A549／DDP耐藥細胞凋亡蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組及順鉑組相比，隨著銀杏酚C17 1濃度的增加，促凋亡蛋白Bax的表達逐漸增強（P＜0.05），而抗凋亡蛋白Bcl2表達逐漸被抑制（P＜0.05）。Bcl2／Bax比值呈現明顯下降趨勢（P＜0.05），故可初步推斷銀杏酚C17 1與順鉑聯用能夠促進耐藥細胞A549／DDP的凋亡。

圖6　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯用對A549／DDP耐藥細胞凋亡蛋白的影響

2.7　銀杏酚C17 1對A549／DDP耐藥細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，對照組自發凋亡率與順鉑組比較無明顯差異（P＞0.05），而銀杏酚C17 1（10，20，40 mg／L）與順鉑聯用后，與對照組及順鉑組相比，早期凋亡率顯著升高（P＜0.05），且呈銀杏酚濃度依賴性。見圖7。由此進一步確定銀杏酚C17 1與順鉑聯用能促進A549／DDP細胞凋亡。

3　討論

肺癌的病死率逐年增加，大多數患者的死亡受到不同程度耐藥的影響［13］。近來研究發現，基于中藥成分的抗癌藥物具有良好的安全性、穩定性和效價高等特點，如銀杏提取物（Ginkgo biloba）［14］。遷移和侵襲能力是腫瘤惡性的生物學標志［15］。本研究Transwell實驗結果顯示，銀杏酚C17 1與順鉑聯用，抑制肺癌耐藥細胞的遷移和侵襲能力且呈濃度依賴性；此外，銀杏酚C17 1作用后，順鉑對A549／DDP細胞的IC50顯著下降，提高了耐藥細胞對順鉑的敏感性。上述結果初步確定銀杏酚C17 1可增強肺癌耐藥細胞對順鉑的敏感性。

圖7　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯用對A549／DDP耐藥細胞凋亡的影響

多藥耐藥的產生機制繁雜，其中Mrp1和肺耐藥蛋白（Lrp）表達改變是耐藥的重要機制之一［16］。Nrf2／Keap1信號通路參與非小細胞肺癌Mrp1的表達調控，當Keap1表達下降或被其他蛋白如P62競爭結合后，致Nrf2入核與ARE元件上的Mrp1基因啟動子結合，促進耐藥蛋白Mrp1的表達［6］。Keap1為Nrf2的負調控蛋白，在一些腫瘤如肺癌細胞中，Keap1的突變致Nrf2活性增強，并與標準化療耐藥及肺癌患者高死亡率相關［17］。本研究顯示，與對照組相比，單獨順鉑組肺癌耐藥細胞株中總Nrf2沒有呈高表達，但核Nrf2高表達，說明細胞內Nrf2的分布發生了變化。胞質Nrf2入核后，促進下游耐藥蛋白Mrp1的高表達，進而抑制藥物進入細胞發揮細胞毒性作用；Keap1作為Nrf2抑制劑，其低表達不僅減少Nrf2的降解，同時增強Nrf2入核進而激活Nrf2。但銀杏酚C17 1與順鉑聯合作用后，與順鉑組相比，細胞內Keap1高表達抑制Nrf2入核，進而核內Nrf2減少，抑制下游耐藥蛋白Mrp1的表達，減弱其發揮藥物外排的作用。由此表明，銀杏酚C17 1可能通過抑制Nrf2／Keap1信號通路逆轉腫瘤細胞對順鉑的耐藥性。

凋亡是耐藥性細胞死亡的重要機制之一，與腫瘤細胞凋亡相關的調控基因有Bcl2、Caspase和P53等家族。Bcl2家族成員Bcl2、Bax、單BH3結構域蛋白等組成一個蛋白質—蛋白質相互作用的網絡，通過線粒體外膜的滲透來調節細胞凋亡［18］。Bcl2是抗凋亡基因，而Bax是促凋亡基因，Bcl2／Bax比值是細胞凋亡發生的關鍵，比值升高抑制腫瘤細胞凋亡，反之降低則促進腫瘤細胞凋亡［19］。本研究結果表明，銀杏酚C17 1與順鉑聯用可促進肺癌耐藥細胞的凋亡，流式細胞術結果進一步證實銀杏酚C17 1增強肺癌耐藥細胞對順鉑的敏感性，并使凋亡增加。

總之，本研究結果表明順鉑與銀杏酚C17 1體外同時作用能對A549／DDP耐藥細胞的增殖、遷移、侵襲、耐藥蛋白及抗凋亡蛋白產生明顯的抑制效果，輔助增敏作用顯著。

［參考文獻］

［1］Zhang Y，Wang X，Han L，et al.Green tea polyphenol EGCG reverse cisplatin resistance of A549／DDP cell line through candidate genes demethylation［J］.Biomed Pharmacother，2015，69：285－290.

［2］Wu T，Wang MC，Jing L，et al.Autophagy facilitates lung adenocarcinoma resistance to cisplatin treatment by activation of AMPK／mTOR signaling pathway［J］.Drug Des Devel Ther，2015，9：6421－6431.

［3］趙瑛.中藥抗腫瘤藥理作用研究進展［J］.現代中西醫結合雜志，2012，21（33）：3752－3753.

［4］Suzuki T，Motohashi H，Yamamoto M.Toward clinical application of the Keap1-Nrf2 pathway［J］.Trends Pharmacol Sci，2013，34（6）：340－346.

［5］Xia C，Bai X，Hou X，etal.Cryptotanshinone reverses cisplatin resistance of human lung carcinoma A549 cells through down-regulating Nrf2 pathway［J］.Cell Physiol Biochem，2015，37（2）：816－824.

［6］Ji L，LiH，Gao P，etal.Nrf2 pathway regulatesmultidrug-resistance-associated protein 1 in small cell lung cancer［J］.PLoSOne，2013，8（5）：e63404.

［7］Taguchi K，Yamamoto M.The KEAP1-NRF2 system in cancer［J］.Front Oncol，2017，7：85.

［8］Hayes JD，McMahon M.NRF2 and KEAP1 mutations：permanent activation of an adaptive response in cancer［J］.Trends Biochem Sci，2009，34（4）：176－188.

［9］Kennedy DO，Wightman EL.Herbal extracts and phytochemicals：plant secondarymetabolites and the enhancement of human brain function［J］.Adv Nutr，2011，2（1）：32－50.

［10］王云飛，楊小明，李月英，等.銀杏酚對 SMMC-7721肝癌細胞和荷H22肝癌小鼠的抗癌作用［J］.江蘇大學學報（醫學版），2013，23（3）：233－237.

［11］Li Y，Liu J，Liu Y，et al.Inhibitory effect of Ginkgol C17 1 on the biological behavior of tumor cells［J］.Oncol Lett，2017，13（3）：1873－1879.

［12］Liu J，Li Y，Yang X，et al.Effects of ginkgol C17 1 on cisplatin induced autophagy and apoptosis in HepG2 cells［J］.Oncol Lett，2018，15（1）：1021－1029.

［13］Troncome M，Cargnelli SM，Villani LA，et al.Targetingmetabolism and AMP-activated kinasewithmetformin to sensitize non-small cell lung cancer（NSCLC）to cytotoxic therapy：translational biology and rationale for current clinical trials［J］.Oncotarget，2017，8（34）：57733－57754.

［14］Mei N，Guo X，Ren Z，et al.Review of Ginkgo bilobainduced toxicity，from experimental studies to human case reports［J］.J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev，2017，35（1）：1－28.

［15］Ramer R，Bublitz K，Freimuth N，et al.Cannabidiol inhibits lung cancer cell invasion and metastasis via intercellular adhesion molecule-1［J］.FASEB J，2012，26（4）：1535－1548.

［16］Swerts K，De Moerloose B，Dhooge C，etal.Prognostic significance of multidrug resistance-related proteins in childhood acute lymphoblastic leukaemia［J］.Eur J Cancer，2006，42（3）：295－309.

［17］Yamadori T，IshiiY，Homma S，etal.Molecularmechanisms for the regulation of Nrf2-mediated cell proliferation in non-small-cell lung cancers［J］.Oncogene，2012，31（45）：4768－4777.

［18］Renault TT，Dejean LM，Manon S.A brewing understanding of the regulation of Bax function by Bcl-xL and Bcl-2［J］.Mech Ageing Dev，2017，161（Pt B）：201－210.

［19］Paul I，Jones JM.Apoptosis block as a barrier to effective therapy in non small cell lung cancer［J］.World J Clin Oncol，2014，5（4）：588－594.