H2-calponin在食管鱗癌中的表達及意義

周玲，凌銳，周月鵬，毛朝明，陳德玉

（江蘇大學附屬醫院1.腫瘤研究中心，2.核醫學科，江蘇鎮江212001）

鈣調理蛋白（calponin）是一類細胞骨架蛋白，其中，中性亞型H2-calponin在多種細胞中通過結合肌動蛋白或者與鈣結合蛋白、輔肌動蛋白等相互作用抑制平滑肌收縮、參與信號轉導以及維持骨架穩定等［1－4］。近來研究證實，H2-calponin參與不同類型腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等，充當著不同甚至相反的角色［5－6］。NF-κB通路是細胞內外信號匯合的關鍵節點，調控腫瘤如食管鱗癌發生、發展的各個環節［7－8］。目前關于 H2-calponin的作用機制尚未明確，因此本文旨在通過比較和分析H2-calponin在食管鱗癌細胞及組織中的表達情況，探討H2-calponin表達與腫瘤進展之間的聯系及相關調控機制。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1組織標本、細胞株 選取2015年6月至2017年6月于江蘇大學附屬醫院胸外科收治的30例食管鱗癌患者（均簽署知情同意書），行食管癌根治術取其癌組織及癌旁組織，經上海芯超生物科技有限公司制成組織芯片。所有患者術前均未接受任何抗癌治療，所有手術標本經甲醛固定后用石蠟包埋，且均通過病理學檢測證實。

人食管鱗狀細胞癌TE-1、ECA109細胞株及正常食管上皮Het-1a細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI 1640培養液和胎牛血清（美國Gibco公司）；兔抗人H2-calponin抗體（Sigma公司）；NF-κB通路抑制劑 PDTC（抑制 IκB磷酸化及阻止NF-κB易位入核）為Selleck公司產品；H2-calponin抗體、鼠抗人增殖細胞核抗原（PCNA）、波性蛋白抗體和鼠抗人β-肌動蛋白（Cell Signaling Technology公司）；兔抗人基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、內皮生長因子-A（VEGF-A）、血管內皮生長因子-C（VEGF-C）均為武漢博士德公司產品；NF-κB通路鼠抗人IκBα抗體、p-IκBα抗體、HRP標記的山羊抗兔或鼠抗體（Cell Signaling Technology公司）；Trizol試劑、反轉錄及熒光定量PCR試劑盒（大連TaKaRa公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（北京Solarbio生物科技有限公司）；Biomate 3s核酸測定儀及Pierce ECL plus Substrate（Thermo Fisher Scientific公司）；Alpha化學發光凝膠成像系統 Fluor Chem FC3（Protein Simple公司）；ELISA試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）。

1.2　方法

1.2.1細胞培養 食管鱗癌 TE-1、ECA109細胞，正常食管上皮Het-1a細胞培養于含10%胎牛血清，1%青霉素和1%鏈霉素混合的RPMI 1640培養基，37℃，5%CO2條件下培養，常規傳代。

1.2.2細胞分組及轉染實驗 轉染前24 h，接種TE-1、ECA109細胞至60 mm培養皿中，5×105個／孔，細胞密度達50%～70%后分3組，空白對照組（常規培養）、陰性對照組（轉染空載體siRNA）以及siRNA-H2-calponin組（轉染 siRNA-H2-calponin）。siRNA-H2-calponin上游序列為 5′-CCAUAUCCCAAUACGUGUUATT-3′，下游 5′-UACACGUAUUGGGAUAUGGTT-3′；空載體上游序列為 5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。將0.8 mL Lipo2000混合不同siRNA或者等體積緩沖液加入預留的2.2 mL純RPMI 1640培養皿中，置于37℃5%CO2培養箱中孵育6 h。之后更換含有血清的普通培養基，分別轉染24 h、48 h后提取RNA或者蛋白質以進行后續實驗。

1.2.3免疫組織化學檢測H2-calponin的表達 將包埋于石蠟的組織芯片常規脫蠟水化，抗原修復，去除內源性過氧化物酶活性，血清封閉處理。加入兔抗人H2-calponin抗體（1∶500），4℃孵育過夜。HRP羊抗兔二抗室溫孵育后DAB顯色，蘇木素復染；乙醇脫水，甘油封片，顯微鏡下（400×）隨機選取5個視野觀察，拍照并統計陽性率或平均分，其中H2-calponin表達強度評分標準如下：陽性（棕色或者深棕色）≥75%記為4分；≥50%且＜75%記為3分；≥20%且＜50%記為2分，≥10%且＜20%記為1分，＜10%記為0分。

1.2.4總 RNA提取和反轉錄 收集“1.2.2”各組細胞，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，核酸測定儀檢測各樣本RNA濃度及確定純度［D（260 nm／280 nm）］在1.8～2.0之間。然后根據反轉錄試劑說明書將總RNA反轉錄合成cDNA，構成10μL反應體系，設定反應條件：37℃15 min；85℃5 s。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測食管鱗癌細胞中相關mRNA的表達量 H2-calponin上游引物序列為5′-ACCTGTTTGAGAGTGGGAACATGA-3′，下游引物為 5′-CGTCGAAATTCCGCTCCTG-3′；VEGF-C上游引物序列為 5′-TGTGTGTCCGTCTACAGATGTG-3′，下游 引 物 為 5′-TCGGCAGGAAGTGTGTATTGG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物為 5′-TGGGTGGAATCATATTGGAAC-3′，均由上海Invitrogen公司合成。PCR反應體系10μL，反應條件：95℃預變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火20 s，共40個循環。采用2－△△Ct法計算mRNA的相對表達量。

1.2.6蛋白質印跡法檢測H2-calponin及浸潤侵襲相關蛋白的表達 取“1.2.2”分組細胞，提取總蛋白，常規測定濃度，煮沸變性；60 V電泳30 min，120 V電泳90 min左右，然后將蛋白轉移至PVDF膜；5%BSA封閉1 h；分別加H2-calponin抗體、鼠抗人PCNA、Vimentin抗體和鼠抗人β-肌動蛋白（稀釋度均1∶1 000），以及兔抗人 VEGF-C、VEGF-A、MMP-2、MMP-9抗體（稀釋度1∶400）于4℃孵育過夜；TBST洗膜4次，每次10 min；加入HRP標記的山羊抗兔或鼠抗體（1∶5 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜4次，每次10 min；ECL顯影凝膠成像系統記錄結果，每組實驗至少重復3次。

研究組70例患者，15例患者尿蛋白呈陽性，陽性率為21.4%；12例尿膽紅素呈陽性，陽性率為17.1%；9例患者尿糖呈陽性，陽性率為12.9%；14例患者尿酮體呈陽性，陽性率為20%。對照組70例健康者，1例患者尿蛋白呈陽性，陽性率為1.4%；0例患者尿膽紅素呈陽性，陽性率為0；0例患者尿糖呈陽性，陽性率為0；0例患者尿酮體呈陽性，陽性率為0。兩組尿常規檢測的陽性率比較，研究組顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

1.2.7ELISA法檢測MMP-2，MMP-9和VEGF-C表達 收集“1.2.2”中3組細胞培養48 h后的上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測各組TE-1細胞上清中MMP-2，MMP-9和VEGF-C的表達水平。

1.2.8PDTC處理 將 PDTC原液（10 mmol／L）以1∶1 000稀釋于RPMI1640培養基中制成終濃度為10μmol／L的工作液。接種TE-1細胞至60 mm培養皿中，5×105／孔，細胞密度達50% ～70%后，分別于0，0.5，1，2，4，8，12 h作換液處理。按“1.2.4”和“1.2.5”方法分別提取RNA進行實時熒光定量PCR實驗。以同樣方法接種TE-1細胞24 h，分為空白對照組、陽性對照組、H2-calponin siRNA組、PDTC處理組；前 3組處理同“1.2.2”，PDTC處理組予以10μmol／L PDTC換液處理，48 h后按“1.2.6”提取蛋白并檢測其表達。

1.3　統計分析

應用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析；計量數據以均數±標準差（±s）表示；組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　H2-calponin在人食管鱗癌組織及細胞中的表達情況

免疫組織化學染色檢測結果顯示，食管鱗癌組織中H2-calponin多呈較低表達，僅在瘤體中心或者腫瘤細胞密集部位可見弱陽性表達；而與之相對應的癌旁組織在上皮層向基底膜之間H2-calponin表達明顯增加，在固有層及其他層均低表達甚至不表達，但總體表達強度高于腫瘤組織（圖1）。H2-calponin陽性表達率與食管鱗癌患者性別、年齡、腫瘤部位及病理分級無明顯相關性（P均＞0.05，表1）。

圖1　食管鱗癌及癌旁組織中H2-calponin的表達（免疫組化×200倍）

表1　食管鱗狀細胞癌組織中H2-calponin的表達與臨床病理特征關系

續表

熒光定量PCR結果顯示，與正常食管上皮Het-1a細胞相比，食管鱗癌ECA109細胞、TE-1細胞中H2-calponin表達明顯降低（P＜0.01）；蛋白質印跡結果與其相一致（圖2）。

圖2　熒光定量PCR和蛋白質印跡檢測3種食管上皮細胞中H2-calponin表達量

2.2　下調H2-calponin表達對增殖、侵襲和轉移相關蛋白的影響

圖3　各組TE-1細胞中增殖、侵襲和轉移相關蛋白的表達

圖4　各組TE-1細胞MMP-2，MMP-9和VEGF-C分泌量

2.3　NF-κB信號通路通過H2-calponin調控食管鱗癌發展進程

熒光定量PCR結果顯示，TE-1細胞在經NF-κB信號通路抑制劑PDTC處理后，H2-calponin mRNA表達量在0.5 h內出現短暫降低，隨后逐漸增加，在2 h即出現明顯增加，而后趨于緩慢，8～12 h時仍高于0 h組（P＜0.01，圖5）；蛋白質印跡結果也證實PDTC處理后TE-1細胞IκBα表達增加促進H2-calponin蛋白表達并上調（P＜0.05，圖6）。

圖5　TE-1細胞經PDTC處理不同時間后H2-calponin mRNA表達量

圖6　各組細胞H2-calponin和NF-κB通路相關蛋白的表達

3　討論

H2-calponin在正常組織和細胞中廣泛存在，對維持機體生理功能及穩定起重要作用［1］。近幾年關于H2-calponin在腫瘤發生發展中的研究廣受關注，例如前列腺癌中低表達的H2-calponin促進細胞增殖［5］；胃癌中敲除H2-calponin則會激活細胞凋亡進程［6］。有文獻指出，食管鱗癌中H2-calponin高表達與患者不良預后存在著潛在的負相關［9］。本研究發現，食管鱗癌組織中H2-calponin總體表達強度低于癌旁組織，腫瘤細胞株低于正常食管上皮細胞。本研究通過siRNA技術發現，下調H2-calponin表達促進浸潤、侵襲相關蛋白的表達以及波形蛋白、MMP-2和MMP-9等細胞因子的合成與分泌，而對增殖相關蛋白PCNA和E-鈣黏蛋白未有明顯影響。腫瘤轉移主要與遺傳異質性、上皮間充質轉化以及血管與淋巴管生成等有關。目前認為，VEGF家族蛋白作為分泌性糖蛋白可通過促進新生淋巴、血管在腫瘤轉移發生中發揮關鍵作用［10］。本研究證實H2-calponin的下調對VEGF-A沒有明顯作用，但VEGF-C蛋白的合成以及外泌水平都出現明顯增加；食管鱗癌最主要的轉移途徑是淋巴管，因此我們認為H2-calponin持續低表達或者抑制是食管鱗癌原位浸潤、侵襲以及轉移重要基礎。

大量的基質細胞、細胞因子及調節因子等構成了腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移所需的環境，而這一微環境的構成離不開腫瘤細胞及關鍵信號通路的調控。其中，NF-κB信號通路的過度活化參與多種腫瘤細胞的惡性增殖、上皮間充質轉化、黏附、MMPs和 VEGF因子分泌等［7，11－12］。研究表明［8，12］，生理情況下NF-κB主要與其抑制蛋白IκBα結合成復合體而處于失活狀態，而腫瘤細胞中的NF-κB則異常活化，主要是由于IκBα持續磷酸化致其解離、釋放并進入核內充當轉錄因子，上調或者抑制相應靶蛋白的表達。本研究顯示，食管鱗癌細胞中也存在著激活的NF-κB信號通路；通過PDTC抑制其活化進入胞核即可在2 h左右恢復H2-calponin的轉錄；PDTC處理后IκB的累積與H2-calponin蛋白表達的上調同步，即食管鱗癌細胞中NF-κB的過度激活是H2-calponin表達抑制的基礎。綜上所述，NF-κB通路通過抑制H2-calponin表達，促進食管鱗癌的侵襲和轉移。通過調控關鍵信號通路無疑為腫瘤的靶向治療提供了方向，但實際應用于臨床還存在諸多問題，例如缺乏可預測敏感程度的生物標志，是否存在著未知的反饋或調節機制以及多靶點聯合作用的必要性等，也有待進一步揭示和探討。

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